紅柄白鵑梅葉中黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取研究

鄧榮華，王 穎，王 慧，郭曉宏，魏學(xué)智

(山西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041004)

紅柄白鵑梅葉中黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取研究

鄧榮華，王 穎，王 慧，郭曉宏，魏學(xué)智*

(山西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041004)

采用乙醇提取，用分光光度法測(cè)定的方法，以紅柄白鵑梅為原料，通過(guò)正交試驗(yàn)研究了乙醇濃度，提取溫度，提取時(shí)間和料液比4個(gè)因素對(duì)提取紅柄白鵑梅葉片中總黃酮含量的影響。研究結(jié)果表明，各試驗(yàn)因素對(duì)紅柄白鵑梅葉中黃酮類(lèi)物質(zhì)提取量的影響依料液比、提取溫度、乙醇濃度、提取時(shí)間因素順次降低，當(dāng)提取溫度為70 ℃、提取時(shí)間為2 h、料液比為1 ∶20時(shí)，提取效果最好,黃酮類(lèi)物質(zhì)提取量為22.412 mg/g。

紅柄白鵑梅；黃酮類(lèi)；提取

紅柄白鵑梅(Exochordagiraldii)又名金瓜果、輪板芽，屬薔薇科白鵑梅屬落葉灌木，廣泛分布于河南、陜西、湖北、山西、江蘇和甘肅等地，山西境內(nèi)主要分布于呂梁山、太岳山、中條山等山區(qū)，海拔約700 m～1 600 m處[1]。紅柄白鵑梅是一種天然的綠色食品，是山西臨汾洪洞等山區(qū)民間的傳統(tǒng)野菜。春季時(shí)節(jié)采摘其嫩莖、幼葉和花蕾，用開(kāi)水淖后涼拌味鮮可口，還可以和面蒸食、炒食。也可以鹽漬、晾干制成干菜長(zhǎng)期保存以備食用，或制作罐頭[2]。除此之外，它還可作為退耕還林樹(shù)種，既有經(jīng)濟(jì)價(jià)值又有生態(tài)效益，而且具有觀賞價(jià)值。近年來(lái)，關(guān)于植物黃酮類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)、功能作用及提取的研究受到廣大學(xué)者的青睞[3-10]，天然植物黃酮類(lèi)物質(zhì)具有抗菌、消炎、降壓、清熱解毒、鎮(zhèn)靜、利尿以及清除氧自由基等多種重要的生物活性[11-12]，并且其提取物已廣泛應(yīng)用于藥品、化妝品、食品等產(chǎn)品中[13-14]。

我國(guó)紅柄白鵑梅具有豐富的野生資源，但長(zhǎng)期以來(lái)利用率極低僅限于局部地區(qū)采集食用,基本上處于自生自滅狀態(tài)，沒(méi)有充分開(kāi)發(fā)利用[15]。有學(xué)者對(duì)紅柄白鵑梅中的營(yíng)養(yǎng)成分[15-16]、引種栽培[17]以及在山西霍山的群落特征[18]進(jìn)行了研究，但有關(guān)紅柄白鵑梅中黃酮類(lèi)物質(zhì)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用乙醇提取，用分光光度法測(cè)定的方法，通過(guò)正交試驗(yàn)研究乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間和料液比4個(gè)因素對(duì)提取紅柄白鵑梅葉片中總黃酮含量的影響。從而對(duì)紅柄白鵑梅葉中黃酮類(lèi)物質(zhì)的含量進(jìn)行初步分析研究，不僅為開(kāi)發(fā)利用白鵑梅資源提供科學(xué)依據(jù)，而且為農(nóng)村調(diào)整農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)和脫貧致富提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料

紅柄白鵑梅葉：山西省臨汾市堯都區(qū)河底鄉(xiāng)、枕頭鄉(xiāng)采集的紅柄白鵑梅幼葉，烘干后粉碎。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；C2H5OH, NaNO2, NaOH, Al(NO3)3所有試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

DELI-500A型中藥粉碎機(jī)(廣州大祥電子機(jī)械設(shè)備有限公司)；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海青浦滬西儀器廠)；WFJ-7200型可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海龍尼柯儀器有限公司)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；101-3BS型電熱鼓風(fēng)干燥箱(金壇市榮華儀器有限公司)；FA1004A型電子天平(上海維菱科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理

于4月份選取生長(zhǎng)較茂盛的紅柄白鵑梅植株，采摘無(wú)病蟲(chóng)害的葉片，洗凈晾干，50～60 ℃烘箱干燥，粉碎過(guò)篩(60目)，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照梁曉華等人[6]總黃酮的測(cè)定方法。

準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，濃度60%微熱乙醇溶液定容至50 mL，搖勻，得濃度0.1mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0 mL于6只比色管中，加濃度30%乙醇至5 mL，加0.3 mL濃度5 % NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min，加0.3 mL濃度10% Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min，加4 mL濃度1 mol/L NaOH溶液，加0.4 mL蒸餾水，搖勻，靜置15 min，以試劑作為空白參比液，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A。以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，濃度C(mg/mL) 為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，求取線性方程。

得出線性回歸方程：A=0.011 3C+0.000 5(R2=0.999 8)

圖1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.3 紅柄白鵑梅葉黃酮類(lèi)化合物的提取與測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)以70%的乙醇為提取溶劑，超聲波萃取40 min，抽濾得到提取液。

樣品含量測(cè)定：準(zhǔn)確吸取提取液0.2 mL置于潔凈的試管中，加濃度30%的乙醇至5 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法測(cè)定吸光值A(chǔ)，計(jì)算紅柄白鵑梅葉中總黃酮的含量。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

按照1.2.3的方法對(duì)紅柄白鵑梅中黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行提取，并分別考察乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間對(duì)黃酮類(lèi)化合物得率的影響。

1.2.4.1 乙醇濃度對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)提取的影響

在料液比為1 g ∶30 mL，提取溫度為50 ℃，提取時(shí)間為2 h的條件下，考察不同的乙醇濃度(10%，30%，50%，70%，90%)對(duì)紅柄白鵑梅中黃酮類(lèi)化合物得率的影響

1.2.4.2 提取溫度對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)提取的影響

在料液比為1 g ∶30 mL，乙醇濃度為50%，提取時(shí)間為2 h的條件下，考察不同溫度(30 ℃，40 ℃，50 ℃，60 ℃ ，70 ℃，80 ℃)對(duì)紅柄白鵑梅中黃酮類(lèi)化合物得率的影響。

1.2.4.3 料液比對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)提取的影響

在提取溫度為50 ℃，乙醇濃度為50%，提取時(shí)間為2 h的條件下，考察不同料液比(1 ∶5，1 ∶10，1 ∶20，1 ∶30，1 ∶40)對(duì)紅柄白鵑梅中黃酮類(lèi)化合物得率的影響。

1.2.4.4 提取時(shí)間對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)提取的影響

在提取溫度為50 ℃，乙醇濃度為50%，料液比為1 g ∶30 mL的條件下，考察不同提取時(shí)間(1 h，1.5 h，2 h，2.5 h，3 h)對(duì)紅柄白鵑梅中黃酮類(lèi)化合物得率的影響。

1.2.5 正交實(shí)驗(yàn)

黃酮類(lèi)化合物的提取過(guò)程受多個(gè)因素影響，為了得到較科學(xué)的提取工藝條件，將料液比、提取溫度、乙醇濃度和提取時(shí)間4個(gè)單因素為考察對(duì)象，設(shè)計(jì)四因素四水平L16(44)的正交試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對(duì)紅柄白鵑梅葉黃酮類(lèi)化合物提取的影響

圖2 乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響

由圖2曲線可以看出，在乙醇濃度為10%時(shí)，黃酮的得率最低，隨著乙醇濃度的升高，當(dāng)達(dá)到50%時(shí)，得率達(dá)到最大值，而后隨著乙醇濃度的升高得率下降，并且脂溶性的物質(zhì)溶出增多，尤其是葉綠素幾乎完全溶出，給提純?nèi)ルs帶來(lái)較大的麻煩[7]。從成本和提取率來(lái)考慮，乙醇濃度最好控制在30%～60%為好。

2.2 溫度對(duì)紅柄白鵑梅葉黃酮類(lèi)化合物提取的影響

圖3 提取溫度對(duì)黃酮得率的影響

由圖3曲線可知，在30 ℃～60 ℃之間，隨著溫度的升高，所得提取物中黃酮含量呈上升趨勢(shì)，在60 ℃時(shí)，黃酮得率達(dá)最大值，之后隨著溫度的升高，提取物含量有下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)高，一方面其中的活性成分會(huì)收到破壞，雜質(zhì)的溶出量增加；另一方面也會(huì)造成溶劑的損失。綜合以上兩方面的因素，提取時(shí)適宜的溫度應(yīng)為50～70 ℃。

2.3 料液比對(duì)紅柄白鵑梅葉黃酮類(lèi)物質(zhì)提取的影響

圖4 料液比對(duì)黃酮得率的影響

由圖4曲線可知，在料液比為1 ∶5～1 ∶15之間，隨著所加試劑量的增加，所得提取物含量呈上升趨勢(shì)，在1 ∶20時(shí)，黃酮得率達(dá)最大值，之后隨著所加試劑量的進(jìn)一步增加，所得提取物含量有下降趨勢(shì)。從提取效果和減少溶劑用量等方面綜合考慮，用量應(yīng)不宜過(guò)大，故料液比定在1 ∶5～1 ∶20之間比較合適。

2.4 提取時(shí)間對(duì)紅柄白鵑梅葉黃酮類(lèi)物質(zhì)提取的影響

圖5 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響

由圖5曲線可知，在提取時(shí)間為1 h～2 h之間，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，所得提取物中黃酮含量有上升趨勢(shì)，在2 h時(shí)，得率達(dá)最大值，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取物含量有下降趨勢(shì)，這可能由于長(zhǎng)時(shí)間作用破壞了黃酮，在后處理過(guò)程中損失增大而影響黃酮的提出率，造成負(fù)面影響。從節(jié)省原料及實(shí)驗(yàn)周期等各方面考慮，提取時(shí)間控制在1.5 h～2.5 h為宜。

2.5 正交結(jié)果與分析

由表1可知，最佳工藝組合為：料液比1 ∶20，溫度70 ℃，濃度30%，時(shí)間2 h，此條件下所得紅柄白鵑梅葉中黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取量為22.412 mg/g。由表2方差分析可知，4個(gè)因素對(duì)黃酮提取率的影響，料液比和溫度對(duì)提取的影響較為明顯，濃度和時(shí)間的影響相對(duì)較小，即：料液比>溫度>濃度>時(shí)間。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果L16(44)

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

3 結(jié) 論

本研究采用乙醇提取，用分光光度法測(cè)定的方法，通過(guò)四因素四水平正交試驗(yàn)研究了乙醇濃度，提取溫度，提取時(shí)間和料液比4個(gè)因素對(duì)提取紅柄白鵑梅葉片中總黃酮含量的影響，得到各因素對(duì)提取率的影響程度為：料液比>溫度>濃度>時(shí)間。最佳工藝組合為：料液比1 ∶20，溫度70 ℃，濃度30%，時(shí)間2 h，此條件下所得紅柄白鵑梅中黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取量為22.412 mg/g。初步研究表明：紅柄白鵑梅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，是一種極具開(kāi)發(fā)利用的野生資源。

[1] 山西植物志編輯委員會(huì). 山西植物志:第2卷[M]. 北京:中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社, 1998: 216 - 219.

[2] 趙玉平, 魏學(xué)智, 趙國(guó)建.中國(guó)溫帶野菜加工工藝[M]. 太原:山西科學(xué)技術(shù)出版社, 2001:1 - 71.

[3] 陳彥, 林曉艷, 楊志榮. 箭竹葉黃酮類(lèi)物質(zhì)提取條件的優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2003, 24(1): 80-83.

[4] 何書(shū)美,劉敬蘭. 芹菜中黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取和測(cè)定[J]. 分析試驗(yàn)室, 2006, 25(8)：84-87.

[5] 朱宇旌, 張勇, 王純剛, 等. 紅三葉黃酮抗氧化性研究[J]. 食品科技, 2006(4): 78-81.

[6] 梁曉華,徐成東,王陸琴.云南13種蕨類(lèi)植物中總黃酮的測(cè)定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008, 36(19): 7965-7966, 7973.

[7] 李鳳林. 超聲波法提取甘薯葉總黃酮的工藝研究[J].江蘇調(diào)味副食品，2008, 25(3):15.

[8] 唐維媛, 董永康, 王嘯, 等.貴州特產(chǎn)苦蕎麥中總黃酮的提取[J]. 貴州工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版. 2008, 37(4): 178-181.

[9] 馬曉麗. 生物類(lèi)黃酮的研究進(jìn)展[J]．山西職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2005, 15(2): 113-116.

[10] 高中松, 丁文, 高亮, 等. 超聲波提取桑葉中總黃酮的工藝研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2006, 24(4): 122-125.

[11] Rice Evans C, Miller N. The relative anthioxidant activities of plant derived ployphenloic flavonoidsfs[J]. Free Radicalres, 1995, 22(4): 375-383

[12] Lichtblau D, Berger J M, Naknaishi K. Eficient extraction of ginkgolides and bilobalide from Ginkgo biloba leaves[J]. Nat Prod, 2002, 65(10): 1501-1504.

[13] 凌關(guān)庭. 天然食品添加劑[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2000：214-308, 600-601.

[14] 肖崇厚, 陸蘊(yùn)如. 中藥化學(xué)[M].上海: 上?？萍汲霭嫔? 1987：191-250.

[15] 魏學(xué)智, 劉少華, 師學(xué)琴, 等. 紅柄白鵑梅營(yíng)養(yǎng)成分的分析[J].西北植物學(xué)報(bào), 2005, 25(8):1657-1660.

[16] 戢小梅, 陳法志, 董艷芳, 等. 白鵑梅可食部分營(yíng)養(yǎng)成分分析[J]. 園藝與種苗, 2011(4):89-90, 107.

[17] 王軍濤, 高小寧, 查振道. 秦嶺野生紅柄白鵑梅引種栽培[J]. 園林綠化, 2008, 3:43-44.

[18] 張欽弟, 畢潤(rùn)成. 山西霍山紅柄白鵑梅群落特征的研究[J]. 山西師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2006, 20(4):81-84.

Research of Extracting Flavonoids fromEcochordagiraldii

Deng Ronghua, Wang Ying, Wang Hui, Guo Xiaohong, Wei Xuezhi*

(College of Life Science, Shanxi Normal University, Linfen 041004, China)

In this paper, we usedEcochordagiraldiias raw material. The content of flavonoids inEcochordagiraldiiwas extracted by ethanol and determined by spectrophotometry. The orthogonal test was adopted to study the effects of four factors including ratio of material to liquid, extracting temperature, ethanol concentration, extracting time on the extraction rate of flavonoids fromEcochordagiraldiileaves. The results showed that the processing conditions affected the yield, and that the effect of each condition decreased in the following order: ratio of material to liquid, extracting temperature, ethanol concentration, extracting time. The optimum condition of extracting total flavonoids was with 70% ethanol, ratio of material to liquid of 1 ∶20, at 70 ℃, for 2 h, under which the total flavonoids yield could reach 22.412 mg/g.

Exochordagiraldii; flavonoids; extraction

2014-08-21

國(guó)家自然科學(xué)基金(30972396;31300157)；山西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(2009011041-1)。

鄧榮華(1990-)，女，碩士研究生，主要從事植物中活性成分的研究。

*通訊作者：魏學(xué)智，教授，主要從事植物學(xué)的科研和教學(xué)工作。E-mail:wxz3288@163.com

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.02.002

Q946.8;Q949.91

A

1006-9690(2015)02-0005-04