抗癌方有效部位群對荷瘤小鼠的抑瘤作用*

李 雅 范引科 姜姍姍 楊 潔 趙 崗 謝人明

陜西省腫瘤醫(yī)院 (西安 710061)

抗癌方有效部位群對荷瘤小鼠的抑瘤作用*

李 雅 范引科△姜姍姍△楊 潔△趙 崗△謝人明△

陜西省腫瘤醫(yī)院 (西安 710061)

目的：觀察抗癌方有效部位群對小鼠移植性S180肉瘤、H22肝癌瘤體的抑制作用及腫瘤壞死因子(TNF)活性的影響。方法：通過小鼠移植性S180肉瘤生長試驗、小鼠移植性H22肝癌瘤株生長試驗及采用MTT法測定腫瘤壞死因子(TNF)活性試驗，觀察抗癌方對S180荷瘤小鼠、H22荷瘤小鼠的瘤體重量、抑瘤率及腫瘤壞死因子(TNF)活性的影響。結(jié)果：抗癌方大劑量組(1.00g/kg)、中劑量組(0.50g/kg)、小劑量組(0.25g/kg)能夠明顯抑制小鼠移植性S180、H22荷瘤小鼠瘤體的生長，減少瘤體重量、增強抑瘤率(P<0.01，P<0.05)；抗癌方大劑量組(1.00g/kg)、中劑量組(0.50g/kg) 明顯升高TNF活性(P<0.05或0.01)。結(jié)論：抗癌方對小鼠移植性S180肉瘤、H22肝癌具有顯著的抑瘤作用，增強腫瘤壞死因子(TNF)活性是其可能作用機制之一。

惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴重的疾病之一，我國已進入老齡化社會，腫瘤發(fā)病率及死亡率呈高發(fā)趨勢，從天然植物中尋找低毒、高效的抗癌活性成分藥物仍是近年來國內(nèi)外學(xué)者熱衷的研究課題。

抗癌方有效部位群(簡稱抗癌方)出自我院名老中醫(yī)驗方，由蟾皮、莪術(shù)、延胡索等諸藥配伍組合而成，具有解毒散結(jié)，活血祛瘀，行氣止痛之功效。臨床觀察證實用于肝癌、胃癌等多種腫瘤及癌痛的治療具有較好效果。我們通過抑瘤實驗等系列全面探討抗癌方抗腫瘤作用與機理，為闡明其科學(xué)內(nèi)涵，進一步臨床應(yīng)用提供充分的科學(xué)依據(jù)。

1 實驗材料 1.1 受試藥物 抗癌方，由蟾皮、莪術(shù)、延胡索等諸藥經(jīng)提取得到有效部位配伍組合而成,含蟾毒配基類化合物，莪術(shù)揮發(fā)油類，異喹啉類生物堿等多種成分，具有解毒散結(jié)，活血祛瘀，行氣止痛之功效。1g藥粉相當3.02 g原生藥。

1.2 陽性藥物 注射用環(huán)磷酰胺，批準文號(國藥準字號H14023686)，山西普德藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：0.2g。

1.3 瘤 株 小鼠S180肉瘤細胞株，肝癌H22細胞株，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。

1.4 實驗動物 KM小鼠，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，體重18～22g，許可證號：SCXK(陜)2010-001。

1.5 試劑及儀器 氯化鈉注射液:西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；標準胎牛血清： TBD31HB， 100mL，Gibco公司；胰蛋白酶消化液：西安舟鼎國公司；二甲基亞砜(DMSO)：美國Solarbio公司；刀豆蛋白A(ConA)：西安舟鼎國公司；RPMI-1640 ：Gbico公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)：西安舟鼎國公司； 96孔培養(yǎng)板:美國Corning公司；電子天平：型號：BS210S 北京賽多利斯天平廠；普通光學(xué)顯微鏡：olympus 生產(chǎn)；SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺，型號：NO.0904192，蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)；恒溫培養(yǎng)箱：Heraeus ；酶標儀：BIO-RAD Model 680 serial NO.13628 Made in Japan。

2 實驗方法 2.1抗癌方對小鼠移植性S180肉瘤生長的影響 按文獻方法[1-2]，取KM小鼠50只，體重18～22g，每次試驗均采用單一性別，在潔凈工作臺內(nèi)制備瘤細胞懸液(1×107個/mL)，每只小鼠無菌條件下腋下接種瘤細胞懸液0.2mL，計瘤細胞數(shù)約為2×106個。24h后按體重隨機分為5組，分別為荷瘤對照組(常水,10mL/kg)、陽性對照組(環(huán)磷酰胺,20mg/kg)和抗癌方大劑量組(1.00g/kg)、中劑量組(0.50g/kg)、小劑量組(0.25g/kg)。各組灌胃體積均為10mL/kg，1d1次，連續(xù)給藥10d。末次給藥后次日，稱體重后處死小鼠，剖取瘤塊，計算體重和抑瘤率,試驗重復(fù)2次, 統(tǒng)計學(xué)處理t檢驗。

2.2 抗癌方對小鼠H22肝癌瘤株生長及腫瘤壞死因子(TNF)活性的影響 2.2.1 按文獻方法[1-2]，KM小鼠50只，雄性，體重 18～22g。在潔凈工作臺內(nèi)無菌操作制備小鼠肝癌瘤細胞懸液(1×107個/mL)，每只小鼠無菌條件下右前肢腋部皮下接種肝癌細胞懸液0.2mL，計瘤細胞數(shù)約為2×106個。24h后按體重隨機分為五組: 荷瘤對照組(常水,10mL/kg)、陽性對照組(環(huán)磷酰胺,20mg/kg)和抗癌方大劑量組(1.00g/kg)、中劑量組(0.50g/kg)、小劑量組(0.25g/kg)。各組灌胃體積均為10mL/kg，1d1次，連續(xù)給藥10d。 末次給藥后1.5h,稱小鼠體重后處死，無菌制備脾細胞懸液[3]；解剖取瘤稱重，按公式計算腫瘤抑瘤率，統(tǒng)計學(xué)處理t檢驗。

2.2.2 TNF的誘生活性測定[3]:將制備的小鼠脾細胞懸液用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1×106/mL，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔500μL，每孔再加終濃度為5μg/mL的ConA，500μL/孔，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，取上清液備用。

采用MTT法測定TNF的活性[3]將生長良好的L929細胞消化液消化配制成4×105/mL，接種于96孔培養(yǎng)板100μL/孔，將待測樣品也加入培養(yǎng)板100μL/孔，每只待測樣品均設(shè)5孔，同時設(shè)靶細胞對照，加入靶細胞和RPMI-1640各100μL。37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，輕輕吸去上清液100μL，加入MTT(1mg/mL)試液100μL，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h后，吸棄上清液，每孔加DMSO100μL，作用30min，用酶標測定儀測570nm處的吸收度,統(tǒng)計學(xué)處理采用t檢驗。

3 實驗結(jié)果 3.1 抗癌方對小鼠移植性S180肉瘤生長的影響 由表1、表2結(jié)果可見：抗癌方大劑量組(1.00g/kg)、中劑量組(0.50g/kg)、小劑量組(0.25g/kg)、 陽性對照組(環(huán)磷酰胺,20mg/kg)能明顯抑制小鼠移植性S180瘤體的生長(P<0.01,P<0.05)，且呈一定劑量關(guān)系。

表1 抗癌方對小鼠移植性S180肉瘤生長的影響(♂)

注：與荷瘤對照組相比,△P<0.05；▲P<0.01

表2 抗癌方對小鼠移植性S180肉瘤生長的影響(♀)

注：與荷瘤對照組比較,△P<0.05；▲P<0.01

3.2抗癌方對小鼠H22肝癌瘤體生長的影響 由表3結(jié)果可見：抗癌方大劑量組(1.00g/kg)、中劑量組(0.50g/kg)、小劑量組(0.25g/kg)、 陽性對照組(環(huán)磷酰胺,20mg/kg)明顯抑制小鼠移植性H22肝癌瘤體的生長(P<0.01)，抑瘤率分別達到57.20%、46.51%、36.74%、78.60%，試驗呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。

表3 抗癌方對小鼠移植性肝癌生長的影響

注：與荷瘤對照組相比: △P<0.05；▲P<0.01

3.3 抗癌方對小鼠H22肝癌瘤株TNF(腫瘤壞死因子)活性測定 由表4結(jié)果可見：抗癌方大劑量組(1.00g/kg)、中劑量組(0.50g/kg)與荷瘤對照組比較TNF活性明顯升高 (P<0.05或0.01)，環(huán)磷酰胺組與荷瘤對照組比較，具有降低TNF活性的作用(P<0.01)。

表4 抗癌方對小鼠H22肝癌瘤株

注：與荷瘤對照組相比: △P<0.05 ；▲P<0.01

4 討 論 惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴重的疾病之一，腫瘤發(fā)病率及死亡率呈高發(fā)趨勢。2l世紀初，我國每年死于癌癥的人數(shù)已高達150萬[4]。

近年來的研究表明，蟾皮抗腫瘤作用主要是蟾毒配基類，對白血病細胞、實體瘤細胞都有生長抑制和誘導(dǎo)分化作用，證實它可以誘導(dǎo)腫瘤細胞的分化和凋亡還能抑制腫瘤血管和血管內(nèi)皮增生[5]。國內(nèi)學(xué)者已從不同角度和層次證明了莪術(shù)及其抗腫瘤成分莪術(shù)醇、欖香烯、莪術(shù)酮等的抗腫瘤作用[6]；延胡索的主要成分中延胡索乙素鎮(zhèn)痛作用最強,科學(xué)實驗表明延胡索具有很好的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和催眠的藥理作用[7]。TNF是迄今發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用最強的生物學(xué)活性因子之一，能選擇性殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤細胞增殖，而不影響正常細胞的生長、分化和代謝功能，且能協(xié)同其它生物學(xué)因子功能，擴大抗腫瘤譜[3]。

本研究結(jié)果表明抗癌方對小鼠移植性S180肉瘤、H22肝癌具有顯著的抑瘤作用，能夠增強腫瘤壞死因子(TNF)活性。實驗結(jié)果提示抗癌方既具有抑制腫瘤生長的作用，又具有調(diào)節(jié)抗腫瘤細胞活性因子TNF增強對腫瘤細胞的殺傷作用。說明抗癌方可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生TNF,通過TNF直接殺傷腫瘤細胞是其抗腫瘤作用機制之一。

抗癌方中多種中藥來源的化學(xué)成分不僅對腫瘤細胞具有直接的細胞毒殺傷作用,而且能夠從不同途徑提高腫瘤患者的免疫功能,這將為我們找到療效確切、毒副作用小的抗腫瘤藥物而奠定基礎(chǔ)[8]。我們將繼續(xù)通過抗腫瘤免疫實驗等進一步全面探討抗癌方抗腫瘤作用與機理，為臨床應(yīng)用提供充分的科學(xué)依據(jù)。

[1] 魏 偉.藥理實驗方法學(xué)[M].第四版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010： 1072-1074.

[2] 陳 奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].第三版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011: 706-712.

[3] (美)拉波薩塔(Laposata；M.)原著.高德祿,張世俊,主譯.臨床免疫學(xué)方法[M]. 北京：人民軍醫(yī)出版社,2012:512-515,638-651.

[4] 吳 菲,林國楨,張晉昕.我國惡性腫瘤發(fā)病現(xiàn)狀及趨勢[J].中國腫瘤,2012,21(2):81-83.

[5] 王曉東,嚴子平,張 莉,等.蟾皮提取分離方法及有效成分的研究進展[J]. 武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2011,24(12):1757-1767.

[6] 徐燕萍,胡小慶,湛學(xué)軍.莪術(shù)對免疫抑制小鼠免疫功能的影響[J].山東醫(yī)藥,2012,52(4):51-53.

[7] 呂子明,孫武興,段緒紅,等. 延胡索化學(xué)成分研究 [J].中國中藥雜志,2012,32(2):1757-1767.

[8] 白 云,劉 萍,賈博宇.中藥抗腫瘤作用的研究進展[J].中國藥師,2014,17(8):1406-1409.

(收稿2015-06-05；修回2015-07-19)

*陜西省中醫(yī)藥管理局課題(2012-JC18)

@抗癌方 腫瘤壞死因子 動物實驗 小鼠

R73-3

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.11.047

△陜西省中醫(yī)藥研究院(西安 710003)