腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌腎臟保護(hù)性生長因子的作用

張曉鳳 樊 平 田 耘 陜西省中醫(yī)醫(yī)院腎病科(西安 710003)

腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌腎臟保護(hù)性生長因子的作用

張曉鳳 樊 平 田 耘 陜西省中醫(yī)醫(yī)院腎病科(西安 710003)

目的：探討腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清對(duì)大鼠MSCs分泌腎臟保護(hù)性生長因子HGF、BMP-7的作用。方法：灌胃法制備腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清。采用密度梯度離心法分離和培養(yǎng)大鼠MSCs，取第三代MSCs，分別加入腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清和對(duì)照血清體外對(duì)MSCs進(jìn)行培養(yǎng)，至第10d，應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)兩組MSCs分泌HGF、BMP-7的mRNA表達(dá)情況進(jìn)行比較。結(jié)果：培養(yǎng)10d后，腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清組培養(yǎng)的MSCs分泌HGF、BMP-7的mRNA表達(dá)高于對(duì)照組。結(jié)論：腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清可上調(diào)MSCs分泌腎臟保護(hù)性生長因子HGF、BMP-7的表達(dá)，從而對(duì)腎間質(zhì)纖維化發(fā)揮修復(fù)作用。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有自我更新、多系分化和高度增殖的細(xì)胞，易于分離培養(yǎng)、擴(kuò)增，移植時(shí)不存在組織配型、免疫排斥及倫理等問題，日益成為細(xì)胞移植和組織工程中的理想種子細(xì)胞[1]。MSCs以旁分泌方式分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，促進(jìn)周圍細(xì)胞的存活，完成腎小管修復(fù)是其發(fā)揮腎間質(zhì)纖維化治療的主要機(jī)制[2]。MSCs的這種旁分泌作用與中藥復(fù)方配伍治療疾病的作用機(jī)制非常相似。有研究報(bào)道某些益氣活血降濁的中藥復(fù)方和溫陽補(bǔ)腎的中藥單體具有體外促進(jìn)MSCs分泌細(xì)胞因子的作用[3, 4]。益腎散結(jié)法是中醫(yī)治療慢性腎臟病的常用法則, 基于此法則研制的中藥復(fù)方腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊是治療腎間質(zhì)纖維化的有效方劑[5]。既往研究表明，腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊可減少腎臟局部轉(zhuǎn)化生長因子β 1(transforming growth factorβ 1，TGF-β1) 和纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor1，PAI-1)的表達(dá)。本此利用含藥血清技術(shù)研究腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊是否具有體外促進(jìn)MSCs旁分泌HGF、BMP-7的作用，從而探討益腎散結(jié)法與MSCs旁分泌HGF、BMP-7，促進(jìn)腎小管修復(fù)之間的關(guān)系, 為中醫(yī)益腎散結(jié)法治療腎間質(zhì)纖維化提供新的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1 材 料 主要儀器與試劑：醫(yī)用超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(德國HERA cell公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械公司)，DMEM / F12 1∶1培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，優(yōu)質(zhì)胎牛血清(美國Hyclone公司)，胰蛋白酶消化液(美國Sigmar公司)，青霉素和鏈霉素(美國Hyclone公司)，Real-time PCR 儀(美國,Applied Biosystems 7000)，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 MSCs取自于2周齡雄性Sprague-Dawley大鼠骨髓中，經(jīng)體外分離、擴(kuò)增培養(yǎng)。Sprague-Dawley 大鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 藥 物 腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊(菟絲子、丹參、王不留行、鱉甲、僵蠶、山萸肉各12g，金櫻子、淫羊藿、炒杜仲、姜黃、莪術(shù)、赤芍各10g)，由陜西省中醫(yī)醫(yī)院藥劑科提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法 2.1 分 組 Wistar大鼠20只, 分為兩組, 腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊組和生理鹽水對(duì)照組, 分別灌服腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊溶液(450mg/kg·d)及等體積的生理鹽水，1次/d, 連續(xù)10d。

2.2 含藥血清及對(duì)照血清的制備 兩組大鼠于末次給藥后1h開胸心尖取血, 2500rpm離心25min，分離血清, 經(jīng)56℃，30min滅活, 0.22μm濾膜過濾滅菌, -30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 MSCs的分離、純化和培養(yǎng) 取2周齡雄性SD大鼠兩只，頸椎脫臼法處死，浸泡于75%乙醇中15min后，置于超凈臺(tái)中；嚴(yán)格無菌條件下將大鼠下肢皮膚去除，股骨于髖臼處離斷，置于無菌培養(yǎng)皿中。剪除軟組織，剔除股部和腿部肌肉后分離出雙側(cè)股骨及脛骨；將分離的股骨和脛骨放于滅菌PBS中，浸泡5min。剪斷股骨、脛骨兩端骨骺露出骨髓腔，用5mL注射器吸引無血清的培養(yǎng)基，沖出骨髓組織，反復(fù)數(shù)次，至骨髓腔發(fā)白，1000rpm，離心5min，棄上清；在細(xì)胞沉淀中加入含10%FBS，1%青、鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基，充分吹打制成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)細(xì)胞濃度以2×106/cm2的密度接種于25cm2的塑料培養(yǎng)瓶，置于37℃、5 %CO2飽和度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；接種24h后，首次半量換液，之后每3d換液1次。7～10d后待細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)，進(jìn)行傳代。傳代過程如下：棄去培養(yǎng)液后，以37℃預(yù)熱的PBS輕洗兩次，加入含0.25%胰酶的消化液1mL，消化2min后，在倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞皺縮變圓部分脫壁后，終止消化。輕吹打細(xì)胞后收集，1000rpm，離心5min，棄上清；加入10mL含15%FBS的培養(yǎng)基重懸，并以1∶2比例分瓶，即為第1代MSCs (passage 1)，記為P1，將培養(yǎng)瓶置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4～5d后待細(xì)胞長滿80%時(shí)，按以上步驟進(jìn)一步培養(yǎng)傳代。

2.4 含藥血清對(duì)MSCs的體外旁分泌作用 將待處理的MSCs分別移至放有無菌蓋玻片的6孔板中培養(yǎng)成單層，再分別加入腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清及對(duì)照血清，每隔48h換液。于第10d作以下檢測(cè)：應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清對(duì)MSCs分泌HGF、BMP-7的表達(dá)。收集血清處理后的各組細(xì)胞，加入1mL Trizol 提取總 RNA，紫光分光光度儀測(cè)定其純度和含量，凝膠電泳檢測(cè)其完整性。合成的引物序列如下：HGF上游引物5AAGAGTGGCATCAAGTGCCAG-3’,下游引物，5’-CTGGATTGCTTGTGAAACACC-3’；BMP-7上游引物，5’-CTCCACAGGTAGCACACATCAC -3’，下游引物，5’-CCACATCCAGAACCAGAGACTT-3’；GAPDH上游引物, 5’-GTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’，下游引物，5’-TGAGGTCAATGAAGGGGTC-3’?？俁NA樣品用隨機(jī)引物按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 說明合成cDNA 第一鏈，利用Primer-Express (ABI, Foster City, CA)設(shè)計(jì)引物，以其為模板應(yīng)用Prism 7500 real-timePCR 儀進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR 反應(yīng)。所用熒光試劑為SYBR-Green，逆轉(zhuǎn)錄cDNA 樣品擴(kuò)增至反應(yīng)結(jié)束。然后以GAPDH 作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定Ct(cycle threshold)值。以目的基因/GAPDH的比值衡量PCR反應(yīng)產(chǎn)物。

3 結(jié) 果 3.1 MSCs的分離、純化和培養(yǎng) 原代培養(yǎng)的MSCs 24h后開始貼壁，形態(tài)不均一，體積較小，或圓形，或多邊形，或梭形，3d后可形成集落(圖1-1)；7d時(shí)細(xì)胞呈長梭形。細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)，即可進(jìn)行傳代。傳代后的MSCs增殖速度明顯加快，細(xì)胞形態(tài)基本均一，呈紡錘形或長梭形，鋪展?fàn)?，活力好，可見少量未貼壁的雜細(xì)胞。通常情況下，MSCs每5～7d傳代一次，通過換液和傳代的方法可以純化細(xì)胞。第3代MSCs形態(tài)均勻呈成纖維細(xì)胞樣，旋渦狀分布(圖1)。

A：為P0代MSCs，可見細(xì)胞形態(tài)各異，B：為P3代MSCs，可見細(xì)胞形態(tài)均一，成旋渦狀分布

圖1 MSCs形態(tài)圖

3.2 RT-PCR檢測(cè)腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清對(duì)MSCs分泌HGF、BMP-7的作用 腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清組和生理鹽水對(duì)照血清組分別培養(yǎng)細(xì)胞10d后，經(jīng)PCR法檢測(cè)，腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清具有促進(jìn)MSCs分泌抗纖維化因子的作用，藥物作用后的MSCs 分泌的HGF、BMP-7 等細(xì)胞因子表達(dá)明顯上調(diào)，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見表1。

表1 MSCs的HGF、BMP-7 mRNA的表達(dá)

組別HGF/GAPDHBMP-7/GAPDH對(duì)照組0.137±0.0050.271±0.010實(shí)驗(yàn)組0.550±0.056△1.506±0.118△

注：與對(duì)照組比較，△P<0.05

4 討 論 中醫(yī)益腎、散結(jié)治則是用于治療慢性腎臟病的常用法則, 旨在疏通病變部位的脈絡(luò), 改善局部生存狀態(tài), 與促進(jìn)其分泌HGF、BMP-7，參與局部微環(huán)境的重建有相通之處?；诖朔▌t而研制的腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊是臨床治療腎間質(zhì)纖維化的有效方劑。本研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的MSCs在腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清的誘導(dǎo)下，分泌抗纖維化因子HGF、BMP-7的作用明顯增強(qiáng)。HGF、BMP-7可與受損腎臟中的某些細(xì)胞因子結(jié)合刺激腎組織原位干細(xì)胞和殘余腎小管上皮細(xì)胞完成腎小管修復(fù)作用。因此，我們認(rèn)為，腎復(fù)康Ⅱ號(hào)膠囊含藥血清具有體外誘導(dǎo)MSCs旁分泌HGF、BMP-7的作用，為將來協(xié)助MSCs移植治療腎間質(zhì)纖維化提供了可靠的手段和理論依據(jù)。

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(收稿2014-11-01；修回2014-11-20)

血管性頭痛/中醫(yī)藥療法 @葛根通絡(luò)湯

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10.3969/j.issn.1000-7369.2015.02.060