補腎利濕法對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-17表達(dá)水平的影響

姜德友 李文昊 解 穎 隋方宇 孫許濤 韓潔茹 劉彤彤 常佳怡

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱，150040)

補腎利濕法對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-17表達(dá)水平的影響

姜德友 李文昊 解 穎 隋方宇 孫許濤 韓潔茹 劉彤彤 常佳怡

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱，150040)

目的：研究并觀察補腎利濕法對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠白介素17(IL-17)表達(dá)水平的影響，探討補腎利濕法防治急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(Gouty Arthritis，GA)的作用機(jī)制。方法：將84只Wistar大鼠隨機(jī)分為7組：空白組(BG)、模型組(MG)、中藥對照組(CMCG)、西藥對照組(WMCG)及中藥復(fù)方低、中、高濃度組(CMLG、CMMG、CMHG)，每組12只。采用MSU聯(lián)合草酰鉀誘導(dǎo)大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，應(yīng)用ELISA法，分別檢測各組大鼠血清IL-17的含量。結(jié)果：與空白組比較，造模各組大鼠血清IL-17的水平明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，西藥對照組、中藥對照組、中藥復(fù)方低、中、高濃度各組IL-17水平明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；西藥對照組與中藥復(fù)方中濃度組比較，IL-17含量差異不大(P>0.01)。結(jié)論：補腎利濕法處方可明顯抑制急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠IL-17的表達(dá)，對防治痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎具有一定作用。

補腎利濕；痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎；白介素17；實驗研究

痛風(fēng)是以尿酸鹽(Monosodium Urate，MSU)沉積和血尿酸升高為主要病理改變的一種嘌呤代謝紊亂性疾病，其自然病程經(jīng)歷4個階段，分別為無癥狀高尿酸血癥、急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、間歇性痛風(fēng)和慢性痛風(fēng)石性痛風(fēng)[1]。其中，以急性期為主要表現(xiàn)，即關(guān)節(jié)受累出現(xiàn)紅、腫、熱、痛，同時伴有高尿酸血癥和/或尿酸鹽沉積，輕者影響人們生活工作，重者導(dǎo)致肢體活動及功能障礙，累及腎臟引起慢性間質(zhì)性腎炎和尿酸性泌尿系統(tǒng)結(jié)石[2-3]，甚至致殘。西醫(yī)治療以秋水仙堿、苯嗅馬隆、丙磺舒和NSAIDs等藥物為主，近年來亦研究出許多新型治療靶向藥物，如趨化因子CXC1、TNF-α、NALP3炎性小體等[4]，究其不良反應(yīng)較多，以及作用機(jī)制尚不明確，不能徹底解除患者痛苦，因此應(yīng)用安全性高、不良反應(yīng)小的中醫(yī)中藥治療GA已經(jīng)初顯優(yōu)勢，且易于被患者接受。本實驗中應(yīng)用草酰鉀及MSU聯(lián)合作用以建造大鼠急性通風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型[5]，并對比秋水仙堿、中成藥(痛風(fēng)舒)以及補腎利水處方中藥對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-17的表達(dá)，進(jìn)行研究和完善補腎利水法在GA中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠84只，體質(zhì)量180～220 g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物研究中心，合格證號SCXK(黑)2008004，飼養(yǎng)溫度(20±2)℃，相對濕度35%～40%，動物實驗室為高清潔級，良好痛風(fēng)，光照自然，符合《實驗動物環(huán)境及設(shè)施》[6]要求。

1.2 實驗藥物與試劑 秋水仙堿片(西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號140807)。痛風(fēng)舒片(大黃、車前子、澤瀉、川牛膝、防己)(湖北綠金子藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：140301)。補腎利濕法處方[4]由滋生腎氣丸加懷牛膝、土茯苓等組成，方中藥材從黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房一次性選購。微晶MSU結(jié)晶(Sigma，批號CAS1198-77-2)。草酰鉀鹽(Sigma公司，批號CAS2207-75-2)。大鼠白細(xì)胞介素17 ELISA檢測試劑盒(批號201501，南京建成生物工程研究所)。

1.3 溶液準(zhǔn)備

1.3.1 秋水仙堿混懸液 將秋水仙堿片研成細(xì)末，配置成0.028 mg/mL的秋水仙堿混懸液，放于4 ℃恒溫冰箱保存以備使用。

1.3.2 痛風(fēng)舒片溶液 將痛風(fēng)舒片研成細(xì)末，配置成0.029 g/mL的痛風(fēng)舒片溶液，放于4 ℃恒溫冰箱保存以備使用。

1.3.3 補腎利濕法處方中藥溶液 由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房統(tǒng)一規(guī)范化煎煮而成，以中藥原液3.74 mL濃縮成1 mL的比例，于60 ℃水浴中濃縮藥液，密封隔水煮沸消毒，放于4 ℃恒溫冰箱保存以備使用。

1.3.4 MSU溶液 向1 g微晶MSU結(jié)晶中加入滅菌注射用水，配成10 mLMSU溶液。

1.3.5 草酰鉀溶液 將3 g草酰鉀晶體溶解于97 mL生理鹽水，加熱攪拌，配置成97 mL草酰鉀溶液。

1.4 儀器 恒溫散風(fēng)干燥箱(上海一恒，型號：DHG-9140A)；天平AL204(梅特勒公司)；離心機(jī)(美國貝克曼，型號：X-22R)；酶標(biāo)儀(美國伯爵)。

1.5 方法

1.5.1 動物分組 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周的84只Wistar大鼠，并隨機(jī)將其分為7組，即BG、MG、WMCG、CMCG、CMLG、CMMG、CMHG，每組12只。

1.5.2 給藥方法 以每0.1 kg大鼠體質(zhì)量灌胃1 mL為標(biāo)準(zhǔn)，BG和MG分別灌胃生理鹽水；CMCG和WMCG分別灌胃痛風(fēng)舒片溶液和秋水仙堿溶液；CMLG、CMMG分別給予補腎利濕法處方中藥溶液(給藥計量換算比例依次為5 mL/kg、10 mL/kg灌胃，1次/d，連續(xù)7 d；CMHG給予補腎利濕法處方中藥溶液，給藥計量換算比例為20 mL/kg，早晚各1次/d，連續(xù)7 d，末次給藥后造模。

1.5.3 造模方法 除BG外均采用以下方法造模[5]：用3%草酰鉀溶液進(jìn)行腹腔內(nèi)注射0.03 mL/g，15 min后用6號注射針在受試大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)背側(cè)從45度方向插入至脛骨肌鍵內(nèi)側(cè)，將0.2 mL MSU溶液注入到關(guān)節(jié)腔內(nèi)。而BG只采用6號注射針在受試大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)背側(cè)從45度方向插入至脛骨肌腱內(nèi)側(cè)，將0.2 mL注射用水注入到關(guān)節(jié)腔內(nèi)。

1.5.4 IL-17含量測定 各組大鼠造模4 h后，眶下取血后處死，將血樣靜止30 min后以3 800 r/min速度離心15 min，取上清液，按ELISA法試劑盒說明書進(jìn)行檢測各組實驗動物血清IL-17含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 運用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，根據(jù)K-S/S-W描述統(tǒng)計，P>0.05，滿足正態(tài)分布，各組間方差相齊，采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 IL-17含量測定 與BG比較，MG差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與MG相比，除BG以外，其余各組大鼠血清IL-17水平明顯降低，尤其以CMMG和WMCG為顯著，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示補腎利水法處方中藥有效，結(jié)果見表1。

表1 補腎利濕法中藥對各組大鼠血清中IL-17水平比較

注：與BG相比，*P<0.01；與MG相比，△P<0.01；與CMCG相比，▲P<0.01；與WMCG相比，□P<0.01。

2.2 HE染色病理組織學(xué)結(jié)果 電鏡下觀察各組大鼠關(guān)節(jié)腔滑膜細(xì)胞，除BG滑膜細(xì)胞排列整齊、形態(tài)規(guī)則以外，其余各組大鼠滑膜組織均有不同程度壞死，周圍見不同程度的炎性浸潤。MG中各大鼠的右膝關(guān)節(jié)滑膜組織內(nèi)肉眼見不同含量的尿酸鹽結(jié)晶體，電鏡下觀察其炎性反應(yīng)程度不均，有滑膜間質(zhì)水腫表現(xiàn)，并見大量中性粒細(xì)胞浸潤，結(jié)合本次實驗中血尿酸含量提示造模成功。在治療組中，WMCG仍有輕度退變壞死、炎性水腫，但有血管增生；CMCG仍見水腫，炎性反應(yīng)細(xì)胞滲出減少；CMLG可見大量中性粒細(xì)胞浸潤；CMHG亦有退變、水腫的表現(xiàn)；CMMG的炎性表現(xiàn)輕微，無滲出，僅見少量炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤，伴有輕度水腫，見圖1。

圖1 HE染色病理組織學(xué)結(jié)果

3 討論

在痛風(fēng)的炎性反應(yīng)中，除炎性反應(yīng)細(xì)胞因子發(fā)揮重要作用外，促炎性反應(yīng)細(xì)胞因子亦必不可少。細(xì)胞白介素17就是TH17細(xì)胞所分泌的可溶性的前/促炎性反應(yīng)細(xì)胞因子[7-8]，亦是參與由T細(xì)胞介導(dǎo)的滑膜炎性反應(yīng)的最重要的介質(zhì)[9-11]。其在炎性反應(yīng)中起到促炎性反應(yīng)作用，具體表現(xiàn)為兩方面，一方面，實驗研究證明IL-17參與多種細(xì)胞因子的生成，以放大局部炎性反應(yīng)，如白介素6、白介素37[12]以及腫瘤壞死因子α[13-14]；另一方面，相關(guān)實驗研究亦證明IL-17參與部分趨化因子和中性粒細(xì)胞移動因子的產(chǎn)生以促進(jìn)單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞[15-16]等免疫細(xì)胞的迅速聚集，如重組人單核細(xì)胞趨化因子1、白介素8、基質(zhì)金屬蛋白酶等。因此可由本實驗的研究結(jié)果推論，血清白介素17的水平與急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的病情輕重有關(guān)。雖然未有明確實驗研究報道IL-17與痛風(fēng)的直接關(guān)系，但大量研究證實IL-17通過誘發(fā)其他細(xì)胞因子表達(dá)，逐級放大炎性反應(yīng)，最終導(dǎo)致滑膜增生，促進(jìn)了痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病。本實驗中的模型組在造模后，其血清IL-17表達(dá)趨勢顯著上升，而中藥復(fù)方中濃度組的IL-17水平則明顯降低，因此可推論本方對血清IL-17水平有影響，進(jìn)一步證明應(yīng)用IL-17來研究補腎利濕法處方中藥對大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的影響很有意義。

中醫(yī)學(xué)博大精深，縱觀歷代春腳青囊，對痛風(fēng)的認(rèn)識不斷發(fā)展完善，有學(xué)者研究認(rèn)為，痛風(fēng)一詞最早見于《名醫(yī)別錄》中，并于明清時期發(fā)展成熟[17]，在此過程中其辨證論治不勝枚舉，讓越來越多的人認(rèn)為運用中醫(yī)藥治療痛風(fēng)獨具特色，其療效顯著，處方安全，整體調(diào)節(jié)、作用雙向、不良反應(yīng)少[18]，治病求本，不易復(fù)發(fā)等特點深入人心。近代醫(yī)家在前人的基礎(chǔ)上進(jìn)一步總結(jié)，其認(rèn)為痛風(fēng)是由于先天稟賦不足，即腎精不足，間接損及后天脾胃，先天不應(yīng)后天等原因，導(dǎo)致身體機(jī)能減弱，運化不及，濕濁不分，代謝紊亂，同時感受濕熱或風(fēng)寒邪氣，亦或受情志刺激、飲食勞倦等影響，引起濕濁流串、產(chǎn)生筋骨關(guān)節(jié)疼痛、麻木甚則紅腫灼熱等癥狀[19]。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎以腎虛稟賦不足為本，以感受濕熱或風(fēng)寒邪氣為標(biāo)，屬于痛風(fēng)急性發(fā)作的一種情況，治療應(yīng)當(dāng)采用補腎元利水濕之補腎利水法，標(biāo)本兼顧，內(nèi)外同調(diào)。補腎利水法處方是在滋生腎氣丸基礎(chǔ)上加減變化而成，由滋生腎氣丸處方配伍土茯苓、萆薢等中藥組成。通過滋生腎氣丸補腎填精，利水化濁，配伍土茯苓，取其清熱解毒、除濕之功，有人在中藥治療痛風(fēng)的研究中表明，在其納入的57篇文獻(xiàn)中報告使用的中藥共計121種，其中土茯苓的用藥頻次居第二位，占29.75%[20]，可見其在治療痛風(fēng)中的應(yīng)用之多。佐萆薢利水滲濕，以祛除痛風(fēng)患者體內(nèi)的濕濁，諸藥合用，共達(dá)補腎利濕，抗炎鎮(zhèn)痛的作用，臨床研究亦證明本方在控制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的紅、腫、熱、痛等癥狀方面具有明顯療效[21]，因此通過本實驗可推測運用ELISA法檢測急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清白介素17的含量，來判斷補腎利濕處方中藥對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的治療作用很有意義。

[1]Franchi，Eigenbrod T，Muoz-Planillo R，et al.The Inflammasome：a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis[J].NatImmunol,2009,10(3):241-247.

[2]汪少瓊.痛風(fēng)合劑對動物高尿酸血癥及急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的實驗研究[DB/OL].中國優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫,2011.

[3]姜德友,劉爽,韓潔茹,等.補腎利濕法對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠VEGF表達(dá)水平的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2013,19(24):236-237.

[4]Robert Terkeltaub.Novel therapies for treatment of gout and hyperuricemia[J].Arthritis Research&Therapy,2009,11(4):236.

[5]韓潔茹,謝穎,高恩宇,等.補腎利濕法防治痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的實驗研究[J].四川中醫(yī),2011,29(4):26.

[6]GB14925-2010.實驗動物環(huán)境及設(shè)施[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2002.

[7]Cua DJ，Tato M.Innate IL-17-producing cells：the sentinels of the immune system[J].Nat.Rev.Immunol,2010,10(7):479-489.

[8]Lin AM，Rubin CJ，Khandpur R，et al.Mast cells and neutro-philsrelease IL-17 through extracellular trap for mation inpsoriasis.[J].Immunol，2011,187(1):490-500.

[9]韓學(xué)峰.IL-17和YKL-40在慢性鼻-鼻竇炎患者血漿中表達(dá)及其臨床意義[D].濟(jì)南:山東大學(xué),2011.

[10]Lubberts E,van den Berg WB.Cytokines in the pathogenesis of rheumatoid arthritis and collagen-induced arthritis[J].Adv Exp Med Biol,2003(520):194-202.

[11] Sharma S,Kulk N，Nold MF，et al.The IL-1 family member 7b translocates to the nucleus and down-regulates proinflammatory cytokines[J].Immunol，2008,180(8)：5477-5482.

[12]王月儉,常曉天.脂聯(lián)素在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥,2013,8(2):280-282.

[13]Moran EM，Mullan R，McCormick J，et al.Human rheumatoid arthritis tissue production of IL-17A drives matrix and cartilage degradation：synergy with tumour necrosis factor-alpha，Oncostatin M and response to biologic therapies[J].Arthritis Res Ther,2009,11(4):R113.

[14] Kramer JM，Gaffen SL.Interleukin-17：a new paradigm in inflammation,autoimmunity，and therapy[J].Periodontol,2007,78(6)：1083-1093.

[15]Laan M,Palmberg L，Larsson K，et al.Free，soluble interleukin-17 protein during severe inflammation in human airways[J].Eur Respir,2002,19(3):534-537.

[16]王振剛.近10年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療及預(yù)后的變化趨勢[J].中國醫(yī)刊,2013,48(7):10.

[17]陸妍,孟鳳仙,劉慧.中醫(yī)痛風(fēng)相關(guān)病名的演變與發(fā)展[J].世界中醫(yī)藥,2015,10(4):609.

[18]楊保林,丁崗.芪桂痛風(fēng)舒顆粒治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎16例療效觀察[J].中國中藥雜志,2013,38(2):276.

[19]趙樑.中藥治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的實驗研究[D].廣州:廣州中醫(yī)藥大學(xué),2002.

[20]李昕雪.中藥治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的實驗研究[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué),2013.

[21]姜德友,安偉濤,解穎,等.補腎利濕法治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎療效觀察[J].新中醫(yī),2012,44(10):35-36.

(2015-04-14收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

The Effect of Bushen Lishi Method on the Expression of Serum IL-17 Of Rats with Acute Gouty Arthritis

Jiang Deyou, Li Wenhao, Xie Ying, Sui Fangyu, Sun Xutao, Han Jieru, Liu Tongtong, Chang Jiayi

(HeilongjiangUniversityOfChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective:To observe the effect of Bushen Lishi Method on gouty arthritis on rat interleukin 17 (IL-17) expression level and to study the mechanism of Bushen Lishi Method in the prevention and treatment of acute gouty arthritis (GA). Methods: A total of 84 Wistar rats were randomly divided into 7 groups: blank group, model group, Chinese medicine control group, western medicine control group and Chinese medicine with low, medium and high dose groups, with 12 rats in each group. Using the model of uric acid sodium combined with potassium oxonate to induce acute gouty arthritis, and then use ELISA method to detect the content of serum IL-17 of rats. Results: Compared with the blank group, the levels of the serum IL-17 of model group rats were significantly increased, and there was a significant difference (P<0.01); compared with the model group, western medicine control group, Chinese medicine control group, Chinese herbal compound in low, high concentration, the level of IL-17 of which were significantly reduced, and there was a significant difference (P<0.01); western medicine control group compared with Chinese herbal compound in middle concentration, the IL-17 content of them had little difference (P>0.01). Conclusion: The prescription of Bushen Lishi Method can reduce the expression of IL-17 in rats with acute gouty arthritis significantly, which has a certain effect on the prevention and treatment of gouty arthritis.

Bushen Lishi; Gouty arthritis; Interleukin 17; Experimental study

國家自然科學(xué)基金項目(編號：81173170)；黑龍江省普通高等學(xué)校青年學(xué)術(shù)骨干支持計劃(編號：1254G055)

姜德友(1960—),男，黑龍江省牡丹江市東寧縣，博士生導(dǎo)師，博士后，研究方向：經(jīng)方治療疑難雜癥與龍江醫(yī)派研究，E-mail:jiangdeyou@126.com

常佳怡(1983—)，女，黑龍江省，講師，博士，研究方向：從事經(jīng)方治療內(nèi)傷疑難雜病的臨床與基礎(chǔ)研究與龍江醫(yī)派研究，E-mail：26054630@qq.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.10.032