腦爾康對(duì)AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶及腦內(nèi)AchE活性影響的拆方研究*

馬新欣 李 璽 田 苑 王 娟

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心理精神科(西安 710004)

·實(shí)驗(yàn)研究·

腦爾康對(duì)AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶及腦內(nèi)AchE活性影響的拆方研究*

馬新欣 李 璽Δ田 苑 王 娟▲

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心理精神科(西安 710004)

目的：對(duì)復(fù)方中藥腦爾康進(jìn)行拆方研究，篩選出治療阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease ，AD)模型小鼠藥味精簡(jiǎn)，療效較佳的組方。方法：70只小鼠隨機(jī)分為7組，每組10只，采用腹腔注射氯化鋁(AlCl3)溶液建立AD模型小鼠，空白組和模型組每天給予生理鹽水0.5mL灌胃；其余各組每天分別給予相應(yīng)藥物14.3g/kg劑量灌胃，連續(xù)30d。觀察各組小鼠學(xué)習(xí)記憶情況，并測(cè)定其右側(cè)皮質(zhì)、海馬區(qū)AchE活性及其蛋白水平。結(jié)果：各用藥組與模型組比較，全方及拆方1號(hào)學(xué)習(xí)記憶功能明顯改善(P?0.05或P?0.01)，海馬、皮質(zhì)區(qū)AchE活性均明顯降低(P?0.01)，其蛋白水平均明顯升高(P?0.05或P?0.01)；各拆方組分別與全方比較，拆方1號(hào)海馬、皮質(zhì)區(qū)AchE活性降低，其蛋白水平升高程度與全方無(wú)明顯差異，拆方2，3，4號(hào)則均與全方有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P?0.05或P?0.01)；拆方2，3，4號(hào)與拆方1號(hào)比較，除拆方2號(hào)在提高海馬區(qū)蛋白水平與拆方1號(hào)無(wú)明顯差異外，其余各組均與拆方1號(hào)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P?0.05或P?0.01)。結(jié)論：拆方1號(hào)及全方改善AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶，抑制腦內(nèi)AchE活性作用明顯優(yōu)于其他拆方組，兩者療效相當(dāng)，且前者藥味精簡(jiǎn)。

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種中樞神經(jīng)元退行性病變，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知、語(yǔ)言及行為障礙，最終大腦皮質(zhì)及皮質(zhì)下功能喪失致患者死亡，其發(fā)病機(jī)制不明確，中醫(yī)藥是重要治療手段之一[1]。院內(nèi)制劑復(fù)方中藥腦爾康膠囊(陜衛(wèi)藥制劑注字920138號(hào))，由人參、黃芪、益智仁、何首烏、熟地黃、丹參、川芎、石菖蒲、冰片組成，益腎健腦、活血化瘀、補(bǔ)腎生髓，臨床用于抗癡呆治療多年[2]。但腦爾康藥味繁多，如何研制出處方更精練，療效較佳，符合現(xiàn)代中藥特色的抗癡呆新藥目前尚處在探索階段。本文通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析腦爾康拆方組對(duì)AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙及大腦右側(cè)皮質(zhì)、海馬中乙酰膽堿酯酶(Acetylcholine Esterase，AchE)活性的影響，以旨為創(chuàng)制新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法 1.1 動(dòng)物與材料 清潔級(jí)小鼠70只，昆明種，雄性，體重30±2.8g(西安交大醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(陜)08-004)。人參、黃芪、川芎、丹參、益智仁、熟地黃、何首烏、石菖蒲、冰片等生藥飲片，西安交大第二醫(yī)院藥房提供；結(jié)晶氯化鋁分析純(AlCl3·6H2O)，天津津北精細(xì)化工有限公司提供；AchE測(cè)定試劑盒、蛋白定量測(cè)試盒、蛋白標(biāo)準(zhǔn)液均為南京建成生物工程研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 跳臺(tái)儀(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物試驗(yàn)中心提供)，721E型可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司KJ0104102706)，臺(tái)式離心機(jī)，低溫冰箱。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 1.3.1 動(dòng)物分組：70只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后分隨機(jī)為7組：空白組、模型組、腦爾康全方組、拆方1號(hào)組(人參、川芎、熟地黃、冰片)、拆方2號(hào)組(黃芪、丹參、何首烏、石菖蒲)、拆方3號(hào)組(人參、丹參、何首烏、冰片)、拆方4號(hào)組(人參、丹參、益智仁、冰片)。小鼠隨機(jī)分進(jìn)各組，每組10只(在喂養(yǎng)及藥物干預(yù)過程中有個(gè)別小鼠死亡)。在室溫(22±2)℃、濕度40%～50%條件下自由進(jìn)食飲水。

1.3.2 藥品制備：按文獻(xiàn)[3]，黃芪70g，熟地黃、何首烏各35g，人參、川芎、丹參、益智仁、石菖蒲各23g，冰片2.3g。傳統(tǒng)水煎，使含生藥1g/mL，各拆方組生藥量同腦爾康全方，煎法相同，經(jīng)115℃高壓滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆?；AlCl3固體物粉末溶于雙蒸水，濃度配制為10g/L，經(jīng)0.25μm雙層超濾膜過濾待用。

1.3.3 動(dòng)物造模：按文獻(xiàn)[4]，除空白組外，各組小鼠以AlCl3溶液100mg/kg腹腔注射，隔日1次，共40d，造成AD模型；空白對(duì)照組則以生理鹽水0.5 mL腹腔注射，隔日1次，共40d。結(jié)束后采用跳臺(tái)法進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶測(cè)試。

1.3.4 給藥方法：學(xué)習(xí)記憶測(cè)試次日給藥。空白組及模型組給予生理鹽水0.5mL/d灌胃；經(jīng)劑量估換計(jì)算，其余各組給予相應(yīng)藥物14.3g/kg/d劑量灌胃，共30d。結(jié)束后再次采用跳臺(tái)法進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶測(cè)試。

1.3.5 學(xué)習(xí)記憶測(cè)試：采用跳臺(tái)法，測(cè)試儀器為跳臺(tái)儀，將被試小鼠放入其中，5 min后，將其放于測(cè)試儀器的平臺(tái)上，當(dāng)其跳下四肢接觸銅柵時(shí)給予25 V 電壓刺激。學(xué)習(xí)成績(jī)的潛伏期為其逃至平臺(tái)的時(shí)間(s)，學(xué)習(xí)成績(jī)的錯(cuò)誤次數(shù)為5 min 內(nèi)觸電次數(shù)。24 h 后再次進(jìn)行測(cè)試，記憶成績(jī)的潛伏期為再次跳下被電擊的時(shí)間(s)，記憶成績(jī)的錯(cuò)誤次數(shù)為3 min 內(nèi)觸電次數(shù)。

1.4 觀察指標(biāo) 在冰面上準(zhǔn)確分離海馬及皮質(zhì)后，分別稱取海馬及皮質(zhì)組織重量，放入勻漿器中，加9倍生理鹽水制成10%勻漿，4℃，3500r/min離心10min，取上清液用化學(xué)比色法測(cè)定AchE活性，同時(shí)測(cè)蛋白濃度。

2 結(jié) 果 2.1 鋁鹽對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響 見圖1。與空白組比較，各組學(xué)習(xí)記憶錯(cuò)誤次數(shù)及學(xué)習(xí)記憶潛伏期均有明顯差異(P?0.05或P?0.01)。表明慢性鋁中毒對(duì)各組小鼠學(xué)習(xí)記憶均造成一定障礙。

2.2 腦爾康拆方對(duì)AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響 見圖2。①與模型組比較，全方、拆方1號(hào)學(xué)習(xí)與記憶錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少(P?0.01)，各用藥組學(xué)習(xí)潛伏期均明顯縮短(P?0.05或P?0.01)，記憶潛伏期延長(zhǎng)(P?0.01)；②與全方比較，拆方1號(hào)學(xué)習(xí)記憶錯(cuò)誤次數(shù)及潛伏期與其無(wú)明顯差異，拆方2，3，4號(hào)學(xué)習(xí)記憶錯(cuò)誤次數(shù)、學(xué)習(xí)潛伏期與其存在明顯差異(P?0.01)，拆方3，4號(hào)記憶潛伏期與其存在明顯差異(P?0.01)，拆方2號(hào)記憶潛伏期與其無(wú)明顯差異。表明拆方1號(hào)與全方在改善學(xué)習(xí)記憶障礙方面療效較佳，且無(wú)明顯差異。

2.3 腦爾康拆方對(duì)AD模型小鼠海馬和皮質(zhì)組織AchE活性及其蛋白水平的影響 見表1。①與空白組比較，模型組海馬、皮質(zhì)組織AchE活性均明顯升高(P?0.01)，蛋白水平均明顯降低(P?0.05或P?0.01)。②與模型組比較，全方、拆方1號(hào)海馬、皮質(zhì)組織AchE活性均明顯降低(P?0.01)，其蛋白水平均明顯升高(P?0.05或P?0.01)。③拆方2，3，4號(hào)海馬、皮質(zhì)組織AchE活性，蛋白水平均無(wú)明顯差異。④與全方比較，拆方1號(hào)在促進(jìn)腦蛋白的合成、抑制AchE活性方面與全方組無(wú)明顯差異；拆方2，3號(hào)僅在促進(jìn)腦蛋白合成與全方組無(wú)明顯差異；拆方4號(hào)僅在促進(jìn)海馬區(qū)蛋白合成與全方組無(wú)明顯差異。⑤與拆方1號(hào)比較，除拆方2號(hào)在海馬區(qū)蛋白的生成與拆方1號(hào)無(wú)明顯差異外，其余各組在促進(jìn)其蛋白合成，抑制AchE活性方面均有顯著性差異(P?0.05或P?0.01)；拆方2，3，4號(hào)各個(gè)組間比較，均無(wú)明顯差異。

表1 腦爾康拆方對(duì)AD 模型小鼠腦內(nèi)AchE活性及其蛋白水平的影響

注：與空白組比較，ΔP?0.05，▲P?0.01；與模型組比較，◇P?0.05，◆P?0.01；與全方組比較，□P?0.01；與拆方1號(hào)組間比較，■P?0.05，○P?0.01

3 討 論 AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的退行性變被認(rèn)為是造成AD的最重要病理因素之一。目前已公認(rèn)[5]，學(xué)習(xí)記憶與中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)系極為密切，中樞膽堿能通路是構(gòu)成學(xué)習(xí)記憶的主要通路。Ach是其中維持高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)的一種重要神經(jīng)介質(zhì)，AchE的作用是水解Ach生成膽堿和乙酸，在終止神經(jīng)傳遞中起著重要作用。近年來(lái)研究也進(jìn)一步證明[6]，老化與AD病人腦組織AchE活性顯著升高，造成Ach含量不足，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，出現(xiàn)學(xué)習(xí)和認(rèn)知能力下降甚至喪失。因此測(cè)定腦組織中AchE活性，可判斷腦內(nèi)Ach含量變化。鋁能抑制膽堿的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)乙酰膽堿的分解，降低神經(jīng)乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶的活性，提高腦內(nèi)AchE活性。核酸和蛋白質(zhì)是大腦記憶功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，鋁可能通過抑制腦組織蛋白質(zhì)和核酸的合成而降低學(xué)習(xí)記憶功能[7]。

腦爾康中人參、黃芪為君藥；益智仁、何首烏、熟地黃為臣藥；丹參、川芎為佐藥；石菖蒲、冰片為使藥。本實(shí)驗(yàn)采用君臣佐使化裁法[8]進(jìn)行拆方，結(jié)果顯示，各拆方組均能不同程度改善慢性鋁中毒致AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，抑制海馬及皮質(zhì)AchE活性，提高其蛋白水平。其中拆方1號(hào)及全方組作用明顯優(yōu)于其他拆方組(P?0.05或P?0.01)，兩者療效相當(dāng)，但前者藥味精簡(jiǎn)。拆方1號(hào)之所以能與全方組藥效相當(dāng)，可能與人參、川芎、熟地黃、冰片四味藥物效果較強(qiáng)，藥物間協(xié)同作用更強(qiáng)等有關(guān)?，F(xiàn)代藥理學(xué)證明，人參提取物主要成分人參皂甙Rb1能提高大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，減輕AD大鼠海馬及皮質(zhì)神經(jīng)元的Tau蛋白磷酸化水平，并能上調(diào)學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白表達(dá)[9]。劉長(zhǎng)安等[10]研究證明，川芎嗪可降低大鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞高級(jí)糖化終產(chǎn)物受體(RAGE)的表達(dá)，有效抑制神經(jīng)元活性氧產(chǎn)生，使海馬神經(jīng)元在Aβ的毒性作用下其細(xì)胞存活率上升，改善AD大鼠腦組織炎性，進(jìn)而發(fā)揮其抗癡呆及神經(jīng)保護(hù)作用。安紅梅等[11]研究熟地黃可縮短D-半乳糖衰老模型大鼠Morris水迷宮中找到平臺(tái)時(shí)間，提高模型大鼠腦組織SOD、NOS活性，減少M(fèi)DA、LPO含量，減少SA-β-gal陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，從而改善衰老模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

本實(shí)驗(yàn)旨在通過拆方研究減少?gòu)?fù)方制劑中的非藥效因素，提高制劑水平，使復(fù)方腦爾康膠囊處方更為精簡(jiǎn)，療效較佳，從而節(jié)約資源，降低成本，符合目前國(guó)內(nèi)中藥復(fù)方創(chuàng)制新藥的常用方法和科研思路，為拆方后的新方進(jìn)行毒理學(xué)和藥效學(xué)研究打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，推動(dòng)新藥研究，促進(jìn)中藥發(fā)展。如何更好地融會(huì)貫通中醫(yī)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的理論并將其用于指導(dǎo)中藥方劑的拆方研究，如何通過更客觀全面的觀察指標(biāo)分析拆方研究，有待進(jìn)一步改進(jìn)。

[1] 蘇 芮，韓振蘊(yùn)，范吉平，等．中醫(yī)對(duì)老年性癡呆病因病機(jī)及中藥治療研究[J]．中華中醫(yī)藥雜志，2011，26(9)：1917-1920．

[2] 袁海峰，李 璽，張智燕．腦爾康對(duì)AD模型小鼠腦內(nèi)APP，Aβ表達(dá)的影響[J]．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(24)：140-143．

[3] 馬新欣，李 璽，侯吉星，等．腦爾康及其拆方組對(duì)阿爾茨海默病小鼠模型腦內(nèi)BDNF表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(22)：227-232．

[4] 趙保勝，徐暾海．老年性癡呆疾病模型的建立[J]．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17 (6)：274-276．

[5] 張海燕，劉忠錦，廉 潔，等．電針對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠海馬膽堿能神經(jīng)元的影響[J]．中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，10(13)：11-13．

[6] Lombarbo S，Maskos U. Role of the nicotinic acetylcholine receptor in Alzheimer’s Disease pathology and treatment，Neuropharmacology(2014)，http：//dx.doi.org/10.1016/j.neuropharm.2014.11.018.

[7] 袁晉峰，潘寶龍．三氯化鋁對(duì)小鼠認(rèn)知功能的影響[J]．中西醫(yī)結(jié)合心腦血管雜志，2010，8 (11)：1354-1355．

[8] 賈英杰，李小江，張麗麗，等．中藥復(fù)方的拆方研究進(jìn)展[J]．實(shí)用中醫(yī)藥雜志，2011，27(8)：578-580．

[9] 劉甜甜，趙海峰．植物化學(xué)物對(duì)阿爾茨海默病保護(hù)作用研究進(jìn)展[J]．中國(guó)公共衛(wèi)生，2013，29(11)：772-775.

[10] 劉長(zhǎng)安，朱 潔，蔡 標(biāo)，等. 川芎嗪通過抑制RAGE-ERK1/2-p38-NFκB信號(hào)通路及活性氧生成改善阿爾茨海默病大鼠腦組織炎性[J]．中國(guó)藥學(xué)雜志，2014，49(13)：1126-1132.

[11] 安紅梅，史云峰，胡 兵，等. 熟地黃對(duì)D-半乳糖衰老模型大鼠腦衰老的作用研究[J]．中藥藥理與臨床，2008，24(3)：59-60.

(收稿2015-01-23；修回2015-03-05)

Experimental study on decomposing prescription of Naoerkang to effect the learning and memory and AchE activity in the brains of AD mice

The Psychology and Psychiatry department，the Second Affiliated Hospital of Xi’ an Jiaotong University (Xi’ an 710004)

Ma Xinxin Li Xi Tian Yuan et al

Objective：Decompose the Naoerkang to screen one decomposed prescription which has better effect but has fewer ingredients on Alzheimer’s Disease mice. Methods：70 mice were randomly divided into 7 groups，10 for each group，injected AlCl3solution into stomach to made the AD model. Mice of the control and the model groups had been forced to drink saline 0.5mL per day; and mice of the other groups had been forced to drink the response medicine，14.3g/kg per day，for 30 days. observed the learning and memory ability and AchE activity in right cortex and hippocampus in each mouse. Result：Compared with the model group，the whole group and decomposed 1 improved the learning and memory functions obviously(P?0.05 orP?0.01)，decreased the AchE activity obviously(P?0.01)，increased the protein level evidently(P?0.05 orP?0.01) in hippocampus and cortex. All of its decomposed prescriptions compared with the whole group，there were no significant differences existed in decomposed prescription 1 and the whole group，there were significant differences existed in decomposed prescription 2，3，4 and the whole group(P?0.05 orP?0.01). Compared with the decomposed prescription 1，there were significant differences (P?0.05 orP?0.01) existed in decomposed prescription 2，3 and 4 except for increasing the protein level in hippocampus of decomposed prescription 2. Conclusions：decomposed prescription 1 and Naoerkang groups both have better effect of improving the learning and memory functions and inhabiting the AchE activity than any other decomposed prescription，they have the same effect，but the former has fewer ingredients.

NaoErkang Alzheimer’s disease Learning and memory AchE activity Decomposing prescriptions

*陜西省科技發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目[2007K15-05(3)]

Δ通訊作者：西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院老年病科(西安710004)

▲第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗(yàn)中心(西安710032)

腦爾康 阿爾茨海默病 學(xué)習(xí)記憶 乙酰膽堿酯酶活性 拆方研究

R741

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.07.081