參麥注射液聯(lián)合化療對(duì)結(jié)直腸癌Lovo細(xì)胞的增殖抑制作用*

李 俊

上海梅山醫(yī)院腫瘤科 (南京210001)

參麥注射液聯(lián)合化療對(duì)結(jié)直腸癌Lovo細(xì)胞的增殖抑制作用*

李 俊

上海梅山醫(yī)院腫瘤科 (南京210001)

目的：探討參麥注射液在腫瘤抗血管生成作用的時(shí)間窗問題，即最佳用藥時(shí)間。方法：建立荷瘤小鼠模型，觀察參麥注射液聯(lián)合草酸鉑/氟尿嘧啶抑制腫瘤增殖作用并觀察荷瘤小鼠生存期的影響。結(jié)果：參麥聯(lián)合化療對(duì)人腸癌LOVO細(xì)胞及HUVEC的增值抑制作用最明顯，效果高于相同劑量化學(xué)藥物或單藥參麥注射液。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，先給予參麥注射液后給予奧沙利鉑對(duì)腸癌Lovo荷瘤裸鼠皮下移植瘤的抑制作用最大，瘤體體積及重量最小，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用最為明顯，癌細(xì)胞體積減少明顯。結(jié)論：化療前給藥可能是參麥注射液的抗血管生成最佳治療時(shí)間，確切機(jī)制仍需進(jìn)一步探討研究。

結(jié)直腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，有逐年上升的趨勢(shì)[1]。中醫(yī)藥以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在大腸癌的治療中發(fā)揮了不可替代的作用，其在抗腫瘤新生血管生成的作用受到人們的廣泛關(guān)注[2]。參麥近年來研究有一定的抗血管生成作用，參麥注射液聯(lián)合化療藥物使用時(shí)可起到協(xié)同抗血管生成作用，能起到更好的抑制腫瘤細(xì)胞的效果[3]。

本研究通過體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明參麥注射液的抑制腫瘤血管生成作用和化療協(xié)同作用。建立荷瘤小鼠模型，觀察參麥注射液聯(lián)合草酸鉑/氟尿嘧啶抑制腫瘤增殖作用并觀察荷瘤小鼠生存期的影響；體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，觀察參麥注射液抑制血管內(nèi)皮增殖作用；觀察參麥注射液增加上述化療藥物對(duì)腸癌細(xì)胞系的抑制作用。采用參麥注射液協(xié)同化療藥物對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠腸癌細(xì)胞的協(xié)同增敏制作用，探討參麥注射液在腫瘤抗血管生成作用的時(shí)間窗問題，即最佳用藥時(shí)間。

1 實(shí)驗(yàn)選材與實(shí)驗(yàn)方法 1.1 實(shí)驗(yàn)選用動(dòng)物、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)試劑 BALB/ c 裸鼠共計(jì)30只，約6～7 周齡，體重介于16～21g，要求均為雌性，購(gòu)自生物技術(shù)公司，飼養(yǎng)于SPF環(huán)境。人腸癌Lovo細(xì)胞購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)公司，HUVEC細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室自建，培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含10 %新生牛血清，養(yǎng)護(hù)條件為37℃、5 %CO2孵箱。奧沙利鉑(江蘇恒瑞公司)；參麥注射液(正大青春寶公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco BRL) 、新生牛血清(杭州四季青公司) 、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT ,Sigma) 、二甲基亞砜(DMSO ,Sigma) 。

1.2 人腸癌Lovo細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng) 取凍存的人腸癌LoVo細(xì)胞，復(fù)蘇后培養(yǎng)于由RPMI1640培養(yǎng)液中，放置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中，細(xì)胞每2d更換新鮮培養(yǎng)液。

1.3 MTT法檢測(cè)單純奧沙利鉑(以下用OXA代替) 參麥聯(lián)合OXA對(duì)人腸癌LoVo細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的殺傷活性。

1.3.1 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人腸癌LoVo細(xì)胞，采用PBS液配置濃度為1×106/mL細(xì)胞懸液，接種于多孔板中，孔板選用180uL/孔，96孔；分別配置不同濃度的化療藥和參麥注射液濃度，設(shè)生理鹽水對(duì)照組，每組選定3個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h(培養(yǎng)箱為37℃、5%CO2)，加入MTT 10uL，同樣條件繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，加入DMSO100uL。采用酶標(biāo)儀選用570nm波長(zhǎng)測(cè)各孔的吸光度A值，以此計(jì)算細(xì)胞存活率，采用公式為：存活率=(實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%，繪制濃度效應(yīng)曲線，將藥物濃度定為橫軸，存活率定為縱軸，確定半數(shù)抑制(IC50)濃度。

1.3.2 常規(guī)分離培養(yǎng)HUVEC,在含VEGF、B-FGF的EDMM內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)；加入梯度濃度的參麥注射液、OXA誘導(dǎo)，設(shè)生理鹽水對(duì)照組，每組選定3個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h(培養(yǎng)箱為37℃、5%CO2)，加入MTT 10uL，同樣條件繼續(xù)培養(yǎng)4h，取出棄上清，加入DMSO100uL。采用酶標(biāo)儀選用570nm波長(zhǎng)測(cè)各孔的吸光度A值，以此計(jì)算細(xì)胞存活率，采用公式為：存活率=(實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%，繪制濃度效應(yīng)曲線，將藥物濃度定為橫軸，存活率定為縱軸，確定半數(shù)抑制(IC50)濃度。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體內(nèi)抑制腫瘤作用 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人腸癌Lovo細(xì)胞注射于BALB/c裸鼠的右側(cè)后肢根部皮下，數(shù)量為2×10^6/mL個(gè)，體積均為0.1mL/只。2周后選擇荷瘤大小近似的裸鼠共計(jì)15只，隨即分為生理鹽水(對(duì)照組)、OXA組，參麥聯(lián)合OXA組，每組各5只。OXA組腹腔內(nèi)注射1mg/kg的奧沙利鉑0.2mL/只，隔日1次，共3次；參麥聯(lián)合OXA組，先給予參麥注射液，0.2mL/只，隔日1次，共3次，再給予奧沙利鉑0.2mL/只，隔日1次，共3次；NS組腹腔內(nèi)注射生理鹽水，同樣為0.2mL/只，隔日1次，共3次。從治療開始每?jī)商煊糜螛?biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最大縱徑(a)及最大橫徑(b)，計(jì)算腫瘤體積=0.5×a×b2，觀察腫瘤的生長(zhǎng)狀況。治療后第15d采用頸椎脫臼法處死所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取下移植瘤，測(cè)量各瘤重，分別計(jì)算各組荷瘤鼠的瘤重抑瘤率(TWI)，公式為：TWI%=(1-治療組平均瘤重/生理鹽水對(duì)照組平均瘤重)×100%，將瘤體組織置于4%甲醛溶液中固定，送IHC。

1.5 微血管濃度計(jì)算 瘤組織石蠟切片采用SP法染色，操作步驟按試劑盒要求，滴加羊抗小鼠CD31單抗，以PBS代替一抗作對(duì)照，HRP標(biāo)記的兔抗羊多克隆抗體作為二抗，采用標(biāo)準(zhǔn)IHC檢測(cè)流程，以已知陽性的切片作陽性對(duì)照。CD31標(biāo)記微血管，計(jì)數(shù)腫瘤內(nèi)著色的毛細(xì)血管和微小血管。

2 結(jié) 果 2.1 參麥注射液聯(lián)合奧沙利鉑及奧沙利鉑單藥對(duì)人腸癌Lovo細(xì)胞的抑制活性的比較 由表1可以看出，參麥注射液和奧沙利鉑對(duì)人腸癌Lovo細(xì)胞的增值都有抑制作用，但是與單藥相比，聯(lián)合參麥注射液后對(duì)腸癌細(xì)胞的抑制率增加，加入?yún)Ⅺ溩⑸湟汉竽苊黠@提高奧沙利鉑對(duì)腸癌Lovo細(xì)胞的殺傷作用，效果更明顯。

表1 參麥注射液和奧沙利鉑對(duì)Lovo細(xì)胞的抑制活性

2.2 參麥注射液聯(lián)合化療對(duì)腸癌裸鼠移植瘤的抑制作用 由表1可見，先給予參麥再給予化療藥物對(duì)腸癌荷瘤裸鼠的抑制作用最大，腫瘤生長(zhǎng)延緩，體積較小，奧沙利鉑組其次，參麥和化療藥同步及先用化療藥后用參麥效果相差無幾。從表2可以看出，參麥及奧沙利鉑對(duì)于荷瘤裸鼠都有抑瘤作用，而先參麥后給予化療藥物的遺留作用明顯強(qiáng)于兩者單藥或者其他聯(lián)合用藥方式，瘤重抑瘤率差異效果顯著(P<0.05)。參麥聯(lián)合化療與對(duì)照組相比差異有極為顯著(P<0.01)。病理觀察結(jié)果顯示，采用參麥聯(lián)合化療治療組中的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、中性粒細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞壞死程度均明顯高于對(duì)照組，癌細(xì)胞團(tuán)體積，血管反應(yīng)則明顯少于對(duì)照組(見圖1)。

表2 奧沙利鉑、參麥及兩者聯(lián)用對(duì)荷瘤裸鼠的抑瘤作用

Lovo細(xì)胞在對(duì)照組的生長(zhǎng)狀況，HE×100(A)和HE×400(B),聯(lián)合組(參麥+奧沙利鉑)，更多的組織壞死和淋巴浸潤(rùn)，

3 結(jié) 論 參麥注射液組方源于《千金要方》之生脈散，是“生脈散”衍變方，具有益氣養(yǎng)陰之功效，參麥?zhǔn)侨藚⒑望湺M成的復(fù)方。目前參麥注射液的抗血管生成作用的實(shí)驗(yàn)研究層出不窮，但對(duì)參麥注射液的使用時(shí)間問題的研究幾乎沒有。本文通過對(duì)荷瘤裸鼠模型的抑瘤作用，研究在化療的不同時(shí)間段應(yīng)用參麥，通過對(duì)裸鼠的抑瘤情況及瘤體大小的觀察，尋找參麥注射液抗血管生成的最佳治療時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)研究體外結(jié)果表明，參麥聯(lián)合化療對(duì)人腸癌Lovo細(xì)胞及HUVEC的殺傷作用活性最強(qiáng)，明顯高于同等劑量化療藥物或單純用參麥注射液對(duì)細(xì)胞的殺傷活動(dòng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，先給予參麥注射液后給予奧沙利鉑對(duì)腸癌Lovo荷瘤裸鼠皮下移植瘤的抑制作用最大，瘤體體積及重量最小，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增值抑制作用最強(qiáng)，且腫瘤細(xì)胞的體積減少最明顯，壞死癌細(xì)胞量大，癌細(xì)胞周圍的炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。本研究表明給予化療與參麥注射液聯(lián)合，可增強(qiáng)抑制腫瘤細(xì)胞的能力，聯(lián)合用藥后抑制腫瘤細(xì)胞作用增強(qiáng)，起到協(xié)同作用，比單給予參麥注射液或化療效果更強(qiáng)，且先給予參麥后給予化療效果最佳，可能是參麥注射液的最佳抗血管生成時(shí)間。

化學(xué)藥物治療成為抑制腫瘤細(xì)胞的主要手段之一，化學(xué)藥物在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)造成嚴(yán)重的損傷[4]。在治療腫瘤的過程中，對(duì)于腫瘤細(xì)胞的殺傷作用及對(duì)機(jī)體免疫功能的保護(hù)具有相同的重要性，因此，我們致力于尋找一種既能增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能及增強(qiáng)化療療效，又能減少化學(xué)治療帶來的毒副作用的藥物。本研究通過對(duì)參麥注射液聯(lián)合化療對(duì)荷瘤裸鼠的增值已抑制作用，探討參麥注射液在腫瘤抗血管生成作用以及對(duì)化療藥物的增敏作用。研究結(jié)果表明參麥注射液化療前用藥可以顯著提高療效，提高患者生活質(zhì)量及總生存期。化療前給藥可能是參麥注射液的抗血管生成最佳治療時(shí)間，確切機(jī)制仍需進(jìn)一步探討和研究。

[1] 蔣益蘭,荊 珍. 中醫(yī)藥防治大腸癌轉(zhuǎn)移作用和機(jī)制的研究概況[J]. 湖南中醫(yī)雜志, 2009, 25(1)：1376-1379.

[2] 王 程,楊運(yùn)高,王學(xué)良. 活血化瘀經(jīng)典方劑對(duì)小鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型端粒酶及p53、cerbB-2、Bcl - 2 基因表達(dá)的影響[J]. 第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 24(7)：758-760.

[3] 錢曉萍,劉寶瑞,胡 靜,等. 參麥注射液聯(lián)合環(huán)磷酰胺抑制血管生成作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2006, 14(11)：1344-1347.

[4] Zhang L, Yu D, Hicklin DJ, et al. Combined anti2fetal liver kinase 1 monoclonal antibody and continuous low2dose Doxorubicin inhibits angiogenesis and growth of human soft tissue sarcoma xenografts by induction of endothelial cell apop tosis[J]. Cancer Res,2012, 62: 2034-2042.

(收稿2015-01-20;修回2015-02-11)

Shen Mai injection combined with chemotherapy in colorectal cancer Lovo cell inhibition

Department of Oncology, Shanghai Meishan Hospital

(Nanjing 210001) Li Jun

Objective: To investigate the SMI was anti-angiogenic effect in tumor time window problem that optimal treatment time. Methods: The tumor-bearing mice were observed Shenmai injection combined with oxaliplatin / fluorouracil inhibit tumor proliferation and survival of tumor-bearing mice outlook affect period. Results: shenmai combination chemotherapy cytotoxicity in human colon cancer cells and HUVEC Lovo most active, significantly higher than the SMI was measured at the same chemotherapy drugs or simply using. Animal experiments show that SMI was first given after the administration of oxaliplatin Lovo cancer tumor-bearing nude mice maximum inhibition, tumor volume and minimum weight, tumor cell killing effect is most obvious, cancer cell volume decrease significantly. Conclusion: The administration of chemotherapy may be shenmai injection of anti-angiogenic best treatment time, the exact mechanism needs further discussion and study.

Colorectal neoplasms/traditional Chinese medicine therapy Shen Mai Zhu She ye/therapeutic uses

* 南京市醫(yī)藥衛(wèi)生科研項(xiàng)目(YKK10210)

結(jié)直腸腫瘤/中醫(yī)藥療法 參麥注射液/治療應(yīng)用

R735.3

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.05.050