電針足三里對(duì)AD小鼠大腦皮層APP和Aβ表達(dá)的影響*

李 翀 韓燕燕 樊小農(nóng)

天津中醫(yī)藥大學(xué)(天津300193)

電針足三里對(duì)AD小鼠大腦皮層APP和Aβ表達(dá)的影響*

李 翀?韓燕燕?樊小農(nóng)▲

天津中醫(yī)藥大學(xué)(天津300193)

目的:探究電針足三里對(duì)老年癡呆小鼠大腦皮層β-淀粉樣肽前體蛋白(APP)及β-淀粉樣肽蛋白(Aβ)表達(dá)的影響。方法: 將快速老化小鼠SAMP8隨機(jī)分為模型組、電針組和非穴組，并設(shè)同源SAMR1小鼠作為對(duì)照組。電針組給予足三里電針干預(yù)，非穴組針刺雙側(cè)固定非穴位點(diǎn)。應(yīng)用免疫組織化學(xué)SABC法觀察各組小鼠大腦皮層APP及Aβ的表達(dá)情況。結(jié)果:SAMP8大腦皮層內(nèi)APP和Aβ蛋白呈較高表達(dá)的狀態(tài)，電針治療后明顯下調(diào)，與模型組、非穴組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而非穴組與模型組相比，各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論:電針足三里能有效改善AD，其機(jī)制可能與其下調(diào)AD小鼠大腦皮層APP及Aβ蛋白水平的表達(dá)有關(guān)。

阿爾茲海默病(AD)即老年性癡呆，統(tǒng)計(jì)資料顯示我國(guó)目前有老年性癡呆患者約500萬，到2020年患病人數(shù)將超過600萬，并以每年三四十萬人的數(shù)量增長(zhǎng)，給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)和危害[1-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)其尚缺乏理想的治療手段，而中醫(yī)針灸卻有其獨(dú)到之處。

目前有關(guān)針灸治療阿爾茲海默病的研究雖然取得了可觀的進(jìn)展，但針灸是如何對(duì)AD發(fā)揮其治療作用的，尚未達(dá)成共識(shí)。多項(xiàng)研究表明：電針多個(gè)穴位對(duì)AD有較好的療效[4-6]，但其最佳組方目前尚不統(tǒng)一。療效可靠、作用機(jī)制明確的單穴位針灸治療AD鮮見報(bào)道。本研究選取快速老化小鼠SAMP8為研究對(duì)象，以SAMR1小鼠為對(duì)照，觀察電針足三里對(duì)SAMP8鼠大腦皮層β-淀粉樣肽前體蛋白APP及Aβ表達(dá)水平的影響，以探討電針足三里延緩AD進(jìn)程的可能作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料 雄性快速老化小鼠亞系(Senescence-accelerated mouse prone/8，SAMP8)，6月齡，清潔級(jí)，共18只。健康同月齡抗快速老化小鼠亞系(Senescence-accelerated mouse resistancel/1，SAMR1)，清潔級(jí)，共6只。所有小鼠均由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物中心提供。

APP及Aβ兔抗大鼠一抗試劑盒、SABC山羊抗兔二抗試劑盒及DAB顯色劑(北京中杉試劑有限公司)； 圖像分析系統(tǒng)(同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法 2.1 分 組 將18只SAMP8小鼠隨機(jī)分為3組：模型組、電針組和非穴組，每組6只。同源SAMR1小鼠6只，作為對(duì)照組，飼養(yǎng)條件完全相同。

2.2 針刺方法 取穴:根據(jù)華興邦《大鼠穴位圖譜的研制》[7]，足三里穴定位于小腿前外側(cè)，當(dāng)犢鼻下三寸，距脛骨前緣一橫指處。非穴位點(diǎn)定位于季肋部，髂嵴上方約3 mm處。針刺操作:電針組：束縛小鼠，左側(cè)足三里穴處垂直進(jìn)針，進(jìn)針深度5mm，連接電針治療儀，疏密波，電流強(qiáng)度3mA，電針頻率4～30 Hz，刺激10 min 。非穴組：同樣方法針刺雙側(cè)固定非穴位點(diǎn)。模型組和對(duì)照組：不實(shí)施任何針刺。

每日固定同一時(shí)間點(diǎn)針刺1次，第7、14d全部動(dòng)物休息1d，干預(yù)療程共21d。各組小鼠每天以同樣力度、同樣方式，于同樣時(shí)間進(jìn)行抓取、固定。

2.3 觀察指標(biāo)及方法 各組治療結(jié)束處死動(dòng)物后，取其腦組織，放入4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、連續(xù)切片。按照免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行染色并檢測(cè)，每組切片隨機(jī)觀察12個(gè)視野后，精確選取其視野內(nèi)所有陽(yáng)性顆粒，采用圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)陽(yáng)性顆粒的總面積、面積百分比和積分光度，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行定量分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3.1 各組小鼠大腦皮層區(qū)APP蛋白水平表達(dá)比較 光鏡下，APP蛋白表達(dá)的陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞漿內(nèi)，呈棕黃色顆粒。對(duì)照組APP陽(yáng)性細(xì)胞少，散在分布，胞體小，染色淡；模型組與非穴組表現(xiàn)為胞體肥大，染色增強(qiáng)，且數(shù)量增多，與對(duì)照組相比，陽(yáng)性物質(zhì)總面積、百分比及積分光度均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.01，P<0.01)；電針組APP陽(yáng)性細(xì)胞散在分布，與模型組及非穴組比較，胞體變小，數(shù)量減少，染色減弱，陽(yáng)性物質(zhì)總面積、百分比及積分光度均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.01，P<0.01)。非穴組與模型組相比，各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，P>0.05，P>0.05)。結(jié)果見圖1、表1。

表1 各組小鼠大腦皮層區(qū)APP蛋白表達(dá)情況

注：與對(duì)照組比較，△P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05； 與非穴組比較，◇P<0.05

3.2 各組小鼠大腦皮層區(qū)Aβ蛋白水平表達(dá)比較 Aβ陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色。模型組與對(duì)照組相比：胞體增大，突起增粗，表達(dá)增加，陽(yáng)性物質(zhì)總面積、百分比及積分光度均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.01，P<0.01)；電針組與模型組、非穴組相比，各指標(biāo)均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.01，P<0.01)；非穴組與模型組相比，各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，P>0.05，P>0.05)。結(jié)果見圖2、表2。

表2 各組小鼠大腦皮層區(qū)Aβ蛋白表達(dá)情況

注：與對(duì)照組比較，△P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05； 與非穴組比較，◇P<0.05

A：對(duì)照組 B：模型組 C：電針組 D：非穴組

A：對(duì)照組 B：模型組 C：電針組 D：非穴組

4 討 論 AD是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以進(jìn)行性記憶減退和認(rèn)知障礙為主要臨床特征。β-淀粉樣肽蛋白(Aβ)聚集形成老年斑(SP)為其主要病理特征[8-9]。而Aβ由β淀粉樣前體蛋白(APP)水解產(chǎn)生，任何影響APP水解的因素，均可導(dǎo)致Aβ的沉積，從而引起腦部神經(jīng)元的凋亡、壞死及淀粉樣變，此為老年斑形成的始動(dòng)因子及構(gòu)成老年斑的核心組分，進(jìn)而激活膠質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生神經(jīng)毒性。

快速老化小鼠SAMP8既有學(xué)習(xí)記憶缺陷的快速衰老特性，又有淀粉樣變性增加、老年斑等AD的重要特征，是目前較為理想的衰老模型[10]。本實(shí)驗(yàn)試圖通過降低SAMP8小鼠APP和Aβ的表達(dá)來抑制老年斑的形成，降低激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，以達(dá)到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用，從而探究延緩AD進(jìn)程的作用機(jī)理。

國(guó)內(nèi)外有關(guān)治療老年性癡呆的方法目前大多數(shù)仍處于臨床實(shí)驗(yàn)階段，且長(zhǎng)期服用一些西藥極易引起嚴(yán)重的肝腎損傷[11]。針灸療法作為祖國(guó)醫(yī)學(xué)的重要部分，副作用極少，故而，本實(shí)驗(yàn)探究電針對(duì)AD小鼠老化關(guān)鍵性蛋白APP與Aβ表達(dá)影響，為電針治療AD的臨床選穴提供參考。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為AD系老年腎精虧虛、痰凝血瘀所致。足三里為“足陽(yáng)明胃經(jīng)”的主要穴位之一，是一身中重要的強(qiáng)壯大穴。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，按摩或針灸足三里可以調(diào)理脾胃、補(bǔ)中益氣、通經(jīng)活絡(luò)、疏風(fēng)化濕。研究還發(fā)現(xiàn)針刺足三里能使微血管新生，從而增加腦微循環(huán)血流量，改善腦組織供氧[12]。Zhu sx等也報(bào)道電針百會(huì)、太西、足三里可以降低激活的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，從而保護(hù)神經(jīng)元，改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[13]；張雪竹等研究發(fā)現(xiàn)針刺膻中、血海、足三里等穴位能改善腦細(xì)胞病理形態(tài)，從而提高老年癡呆小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，改善其認(rèn)知功能[14]。因此本實(shí)驗(yàn)選取“足三里”為其治療用穴。

實(shí)驗(yàn)以SAMR1小鼠為對(duì)照，觀察電針足三里對(duì)SAMP8小鼠大腦皮層β-淀粉樣肽前體蛋白APP及Aβ表達(dá)水平的影響，結(jié)果顯示：SAMP8模型組小鼠大腦皮層內(nèi)APP和Aβ蛋白呈較高表達(dá)的狀態(tài)，電針治療后明顯下調(diào)，表現(xiàn)為胞體明顯變小，染色強(qiáng)度減弱，數(shù)量減少，陽(yáng)性物質(zhì)總面積、百分比及積分光度均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而電針組APP和Aβ蛋白的表達(dá)較SAMR1對(duì)照組仍高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示電針足三里可明顯降低APP及Aβ的蛋白表達(dá)水平，可在一定程度上改善AD；并且實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)電針組和非穴組相比，APP和Aβ蛋白的表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示電針足三里較其他部位療效可靠、作用明確，具有穴位特異性。

綜上所述，電針足三里可能通過下調(diào)AD小鼠大腦皮層APP及Aβ蛋白的表達(dá)水平，從而抑制老年斑的形成，降低激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，達(dá)到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用，延緩AD進(jìn)程。但是電針足三里治療AD的途徑復(fù)雜多樣，減少APP水解產(chǎn)生Aβ可能僅是途徑之一。此實(shí)驗(yàn)只選用了單個(gè)穴位，為了更好的為臨床服務(wù)，仍需要配穴組方進(jìn)一步驗(yàn)證，從選取最佳組方的角度來探討針灸延緩AD進(jìn)程的作用機(jī)理。

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(收稿2014-11-29;修回2015-01-13)

Effects of electro-acupuncture at “Zusanli” on the expressions of APP and Aβ in the cortex of Alzheimer's disease mice

Tianjin College of Traditional Chinese Medicine(Tianjin 300193)

Li Chong Han Yanyan Fan Xiaonong

Objective:To investigate the expressing levels of APP and Aβ proteins owing to the influence of electro-acupuncture at “Zusanli” in Seneseenee accelerated mice (SAMP8) brain.Methods: The Seneseenee accelerated mice (SAMP8) were randomLy divided into 3 groups: model group, anelectro-acupuncture group, and sham-acupuncture group. The SAMR1 was used as control. The expressing levels of APP and Aβ proteins were evaluated by immunohistochemical assays.Results: The expressing levels of APP and Aβ proteins in the cortex of Seneseenee accelerated mice were high. They were both reduced by electro-acupuncture compared with model group or sham-acupuncture group. The differences were statistically significant(P<0.01，P<0.01). Meanwhile, there were no statistically significant difference between the various indicators in sham-acupuncture group(P>0.05，P>0.05).Conclusion: Alzheimer's disease could be treated effectively by Electro-acupuncture at “Zusanli”. The mechanism was possibly related to the down-regulated expressing levels of APP and Aβ proteins in the cortex of SAMP8.

Alzheimer disease/acupuncture-moxibustion Electroacupuncture Point ST36 Ainmal experimentation Mice

* 天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金項(xiàng)目(20090206)

阿爾茨海默病/針灸療法 電針 穴,足三里 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 小鼠

R749

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.05.049

?天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科(天津300193)

▲天津市針灸研究所(天津300193)