布地奈德對(duì)哮喘大鼠氣道重塑及氣道平滑肌中Toll樣受體4表達(dá)的影響

西安市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科(西安710003) 黃妙毅 杜旭升

布地奈德對(duì)哮喘大鼠氣道重塑及氣道平滑肌中Toll樣受體4表達(dá)的影響

西安市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科(西安710003) 黃妙毅 杜旭升

目的：探討布地奈德對(duì)哮喘大鼠模型氣道重塑及平滑肌中Toll樣受體4表達(dá)的影響。方法：將30只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為支氣管哮喘組(A組)、健康對(duì)照組(B組)、布地奈德治療組(C組)3組，每組10只。制備大鼠肺組織病理切片，HE染色后觀察各組氣道結(jié)構(gòu)改變情況，并測(cè)定支氣管壁厚度(WAt/Pi)、支氣管壁平滑肌厚度(WAm/Pi) 及支氣管平滑肌細(xì)胞核數(shù)(N/Pi) ，利用Western-Blot方法檢測(cè)氣道平滑肌中TLR4的蛋白表達(dá)。結(jié)果：光鏡下可見(jiàn)A組支氣管上皮細(xì)胞脫落、管壁炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、杯狀細(xì)胞增生、基底膜和平滑肌明顯增厚，而C組上述改變較A組明顯減輕。與B組比較，A組支氣管管壁厚度、平滑肌厚度及平滑肌細(xì)胞核數(shù)顯著升高(P<0.01)，與A組比較，C組支氣管管壁厚度、平滑肌厚度及支氣管平滑肌細(xì)胞核數(shù)顯著降低(P<0.01)。A組的TLR4的蛋白水平明顯高于B組及C組(P<0.01)。結(jié)論：吸入布地奈德可以防治氣道重塑，可能通過(guò)抑制TLR4的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

氣道重塑是除氣道慢性炎癥以外支氣管哮喘的又一重要特征，是難治性哮喘的重要因素，近些年越來(lái)越受到人們的重視，氣道重塑病理表現(xiàn)為氣道上皮破壞、杯狀細(xì)胞增生、上皮下膠原沉積及氣道平滑肌增殖等，它已經(jīng)成為哮喘肺功能進(jìn)行性下降和難治性哮喘的病理學(xué)基礎(chǔ)之一[1]。研究表明：Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)可通過(guò)調(diào)節(jié)多種致氣道重塑因子的生成和活化，參與氣道重塑的形成[2]。布地奈德是臨床治療哮喘常用藥物，其抗炎作用明確，但對(duì)氣道重塑的作用及其機(jī)制目前報(bào)道不多。本研究將建立哮喘動(dòng)物模型，探討早期布地奈德治療對(duì)哮喘氣道重塑以及哮喘氣道平滑肌中TLR4表達(dá)的影響。

材料與方法

1 動(dòng)物與材料 SPF級(jí)SD大鼠(雄性，鼠齡6～8周，200～250g),由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；布地奈德(批號(hào)LOT309973，1mg/ 2ml，阿斯利康公司生產(chǎn))；V級(jí)雞卵白蛋白 (OVA，美國(guó)Sigma公司)；兔抗大鼠TLR4單克隆抗體(美國(guó)Imgenex公司)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(武漢博士德公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組與模型建立[3]： 將30只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為支氣管哮喘組(A組)、健康對(duì)照組(B組)和布地奈德治療組(C組)，每組10只。A組：分別于第1天及第8天給每只大鼠皮下注射卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA)10mg和氫氧化鋁凝膠200mg (混合于1ml的PBS緩沖液中)，并同時(shí)腹腔注射滅活百日咳桿菌5×109個(gè)。于第15天開(kāi)始激發(fā)：將大鼠放置于一個(gè)密閉的容器中，用超聲霧化器給予50 ml 2%卵清白蛋白磷酸鹽緩沖液，行霧化吸入刺激，每天1次，每次霧化30 min。持續(xù)時(shí)間6周。B組：對(duì)照組則以磷酸鹽緩沖液代替致敏原于第1及第8天行皮下注射，用生理鹽水代替卵清白蛋白每日霧化吸入。C組：致敏及OVA霧化程序同A組，從第1次激發(fā)起，每日激發(fā)前30min每只大鼠每日吸入布地奈德霧化溶液 (1 mg/2 ml )，每次霧化5 min，持續(xù)時(shí)間共6周。

2.2 標(biāo)本的制備：上述各組動(dòng)物于末次霧化吸入24 h后行頸椎離斷處死，剝離大鼠右肺，分離其氣道平滑肌，即刻凍存于-80℃冰箱，用于Western-Blot檢測(cè)，用4%多聚甲醛6 ml灌注固定左肺氣管，放置于4%多聚甲醛中保存，石蠟包埋，切片經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色行病理學(xué)觀察。

2.3 氣道壁厚度的測(cè)定： 參照文獻(xiàn)[4]方法將待測(cè)切片放在顯微鏡下放大400 倍，該顯微鏡連接計(jì)算機(jī)，在鏡下找到肺內(nèi)支氣管橫斷面，隨機(jī)選取每只大鼠直徑100～200μm完整的小支氣管橫截面5 個(gè)，采用LeikaQ 500分析系統(tǒng)測(cè)定支氣管管腔周長(zhǎng)(Pi)、支氣管管壁面積(WAt)、支氣管平滑肌面積(WAm) 及支氣管壁平滑肌細(xì)胞核數(shù)量(N)，并用Pi進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，分別表示支氣管壁厚度(WAt/Pi)、支氣管壁平滑肌厚度(WAm/Pi)及支氣管壁平滑肌細(xì)胞核數(shù)量(N/Pi)。

2.4 Western -Blot檢測(cè)氣道平滑肌中TLR4蛋白的表達(dá)[5]：支氣管平滑肌放入勻漿器中分散后用蛋白裂解液提取支氣管平滑肌總蛋白，測(cè)定樣本蛋白濃度，分裝后放置于-80℃冰箱保存、待測(cè)。用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離TLR4蛋白，應(yīng)用半干式電轉(zhuǎn)移儀進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后用兔抗鼠TLR4抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG進(jìn)行抗體孵育及顯色處理，等待蛋白條帶顏色深度適當(dāng)，再用PBS漂洗，將濾膜用GBOX HR凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描并讀取各條帶的A值。

結(jié) 果

1 肺組織HE染色 光鏡下觀察結(jié)果顯示：A組氣道壁及氣道平滑肌明顯增厚，黏膜皺褶增多，黏膜下層明顯增寬，管腔狹窄明顯，有時(shí)管腔內(nèi)可見(jiàn)黏液栓堵塞，氣道上皮細(xì)胞可見(jiàn)脫落，杯狀細(xì)胞增多，管周及黏膜下可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。B組未見(jiàn)炎癥反應(yīng)，肺組織形態(tài)正常。C組上述改變與A組比較明顯減輕。

2 支氣管壁厚度、支氣管平滑肌厚度及支氣管平滑肌細(xì)胞核數(shù)量的比較 見(jiàn)表1。A組WAt/Pi、WAm/Pi及N/Pi均高于B組(P<0.01)，C組均低于A組(P<0.01)，但布地奈德治療組高于對(duì)照組(P<0.01)。

3 Western-Blot檢測(cè)氣道平滑肌中TLR4的蛋白水平 見(jiàn)表2。A組的TLR4的蛋白水平明顯高于B組及C組(P<0.01)。

表1 各組大鼠WAt/Pi、WAm/Pi和N/Pi的比較

注：*與B組比較，P<0.01；#與A組比較，P<0.01

表2 各組大鼠氣道平滑肌中TLR4蛋白表達(dá)水平比較±s)

注：*與B組比較，P<0.01；#與A組比較，P<0.01

討 論

支氣管哮喘是一種氣道炎癥性疾病，隨著病程的遷延和氣管炎癥的進(jìn)展，大部分患者會(huì)發(fā)生氣管重塑，氣管重塑是哮喘不可逆性改變的重要原因之一，近期有研究發(fā)現(xiàn)：氣管炎癥與重塑同步發(fā)生[6]，也就是說(shuō)哮喘早期階段就存在了氣管重塑，這就突出了抑制氣管重塑在控制哮喘方面的重要性。而近端支氣管內(nèi)的氣管平滑肌細(xì)胞增多是氣管重塑的重要特征之一。TLR是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的高度保守而古老的天然免疫受體家族，它介導(dǎo)固有免疫和獲得性免疫[7]，國(guó)外的研究報(bào)道TLR4在氣管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)[8，9]。Graaf等證實(shí)[10]：激活TLR4可以促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖，而氣管平滑肌細(xì)胞與血管平滑肌細(xì)胞同屬于平滑肌細(xì)胞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)功能可能有相似之處。本研究結(jié)果顯示：哮喘組TLR4的蛋白水平顯著高于對(duì)照組，它與支氣管壁厚度、支氣管壁平滑肌厚度、支氣管壁平滑肌細(xì)胞核數(shù)量在大鼠氣管中的變化趨勢(shì)一致。因此，我們推測(cè)TLR4可能在哮喘氣管增厚加重氣管重塑中起作用，但其機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

布地奈德是臨床廣泛應(yīng)用的治療哮喘的吸入型糖皮質(zhì)激素，Chen和Khalil研究發(fā)現(xiàn)[11]地塞米松可以抑制體外培養(yǎng)的牛氣管平滑肌細(xì)胞的增殖，進(jìn)而減輕氣管重塑。本研究發(fā)現(xiàn)：C組其平滑肌厚度較A組明顯降低，提示早期應(yīng)用布地奈德吸入可抑制平滑肌厚度的增加，其氣管壁總厚度較A組也明顯降低，提示布地奈德對(duì)改善氣管重塑具有積極的作用。布地奈德治療組氣管平滑肌中TLR4蛋白表達(dá)與哮喘組比較明顯下降。因此推測(cè)布地奈德可能通過(guò)下調(diào)TLR4的表達(dá)改善氣管重塑。

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(收稿：2014-12-10)

致 作 者

為了使本刊規(guī)范統(tǒng)一，凡投入本刊的論文需要使用星號(hào)標(biāo)注、腳注的稿件，必須規(guī)范使用星號(hào)注釋。有課題、基金項(xiàng)目的稿件在文題后用“*”星號(hào)上標(biāo)，在課題、基金項(xiàng)目名稱前加“*”星號(hào)進(jìn)行腳注(兩個(gè)或三個(gè)課題、基金項(xiàng)目者在其名稱之間用"；"分開(kāi))。在沒(méi)有課題、基金項(xiàng)目的作者、表內(nèi)需要加星號(hào)上標(biāo)的，或左下腳、表下需要加星號(hào)進(jìn)行注釋的，一律按層次順序星號(hào)標(biāo)注，上標(biāo)星號(hào)與腳注星號(hào)、表內(nèi)上標(biāo)星號(hào)與表下注釋星號(hào)必須對(duì)應(yīng)一致。星號(hào)的層次順序?yàn)椤?、▲、◇、◆、□、■、○、●、☆、★?0級(jí)。星號(hào)字號(hào)為小五號(hào)字，表內(nèi)星號(hào)可適當(dāng)縮小。使用星號(hào)原則是層次順序清晰、統(tǒng)一、對(duì)應(yīng)一致。

陜西醫(yī)學(xué)、陜西中醫(yī)雜志社

Effect of Budesonide on airway remodeling and TLR4of airway smooth muscle cell in rat models of asthma

Department of Respiratory Disease，Xi’an Central Hospital (Xi’an 710003)

Huang Miaoyi Du Xusheng

Objective:To explore the influence of budesonide on the airway remodeling and TLR4of airway smooth muscle cell in Rat models of asthma. Methods:Thirty SD rats were randomly divided into 3 groups:model group(group A)，normal control group(group B),budesonide treatment group(group C)，with 10 rats in each group.The airway inflammation and the alteration of airway structure were detected by HE staining, The airway wall thickness(WAt/ Pi),the bronchial smooth muscle thickness(WAm/Pi)and numbers of smooth muscle cell (N/Pi )were measured by using image analysis system. the expression of TLR4protein in cells were detected by Western blot.Results:Bronchial epithelial desquamation,inflammatory cell infiltration,hyperplasia of goblet cells and smooth muscle cells were seen in group A under optical microscope,however compared with group A,the manifestations were significantly decreased in group C.Compared with group B,WAt/ Pi , WAm/Pi and N/Pi were expressed at higher levels in lung tissues of group A(P<0.01). Compared with group A,WAt/ Pi ,WAm/Pi and N/Pi were expressed at lower levels in lung tissues of group C(P<0.01). Compared with group B and C,the expression of TLR4at protein levels in group A was significantly highter. Conclusion：The airmay remodeling can be inhibited by budesonide probably through reducing the expression of TLR4.

Asthma/drug therapy Asthma/physiopathology Budesonide/therapeutic use Models,animal Rats

哮喘/藥物療法 哮喘/病理生理學(xué) 布地奈德/治療應(yīng)用 模型，動(dòng)物 大鼠

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.05.004