循環(huán)MPs對(duì)pH大鼠肺動(dòng)脈舒張功能的影響*

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科 (西安 710061)

韓穩(wěn)琦 陳春燕 韓新源△ 潘軍強(qiáng)△ 程 功△ 孫超峰#

循環(huán)MPs對(duì)pH大鼠肺動(dòng)脈舒張功能的影響*

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科 (西安 710061)

韓穩(wěn)琦 陳春燕 韓新源△潘軍強(qiáng)△程 功△孫超峰#

目的： 探討肺動(dòng)脈高壓大鼠體內(nèi)循環(huán)微顆粒(MPs)對(duì)肺動(dòng)脈血管舒張功能的影響，以進(jìn)一步闡述肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制。方法：雄性SD大鼠12只隨機(jī)分為兩組，正常對(duì)照組(C組，n=6)、MCT模型組(M組，n=6)，M組大鼠按照50mg/kg劑量一次性腹腔注射野百合堿誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓模型，C組大鼠一次性腹腔注射與M組等量乙醇生理鹽水混合液；常規(guī)喂養(yǎng)20d后行右室插管測定大鼠右室收縮壓(RVSP)，而后采用腹主動(dòng)脈采血法取血并提取MPs，將提取的MPs刺激大鼠肺動(dòng)脈，觀察MPs對(duì)大鼠肺動(dòng)脈血管舒張功能的影響。結(jié)果：C組來源的MPs對(duì)肺動(dòng)脈血管舒張功能無影響，M組來源的MPs部分抑制肺動(dòng)脈的舒張功能。結(jié)論： 肺動(dòng)脈高壓大鼠體內(nèi)的循環(huán)MPs通過抑制肺動(dòng)脈舒張進(jìn)而加重肺動(dòng)脈高壓的病情進(jìn)展。

肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary hypertension, pH)為一類極度嚴(yán)重的疾病，嚴(yán)重危害患者身心健康。以往研究報(bào)道肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈血管舒張功能顯著受損[1]。循環(huán)微顆粒(Circulating microparticles，MPs)是內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板發(fā)生凋亡或受到病理刺激時(shí)分泌的微粒，參與炎癥反應(yīng)、激活凝血系統(tǒng)及侵蝕內(nèi)皮細(xì)胞[2,3]。近期研究還發(fā)現(xiàn)MPs通過影響內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial Nitric oxide synthase, eNOS)和彈性蛋白(Elastin)參與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生和發(fā)展。我們將通過研究MPs與肺動(dòng)脈血管舒張功能的關(guān)系來進(jìn)一步探討肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠12只，體重200±10g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。

2 試劑和藥品 野百合堿(Monocrotaline, MCT)、氯化乙酰膽堿(Ach)、重酒石酸去甲腎上腺素(Noradrenaline Bitartrate, NA)、戊巴比妥鈉、L-硝基精氨酸(L-NAME)均購自Sigma公司。K-H液配置：NaCl 118.0 mmol/L、CaCl22.5 m mol/L、KH2PO41.2 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、MgSO41.2 mmol/L、NaHCO325.0 mmol/L、glucose 11.0 mmol/L，均為普通國產(chǎn)分析純。

3 儀 器 MD 2000生物信號(hào)采集系統(tǒng)購于南京醫(yī)科大學(xué)，BL-420E生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)購于成都泰盟科技有限公司。

4 pH模型制備及分組 按文獻(xiàn)報(bào)道方法制備pH模型[3]：生理鹽水和乙醇(8∶2)混合液將MCT配制成濃度20 g/L的溶液。將12只雄性SD大鼠隨機(jī)分為：對(duì)照組(C組，n=6)和MCT組(M組，n=6)。M組大鼠以50 mg/kg比例一次性腹腔注射MCT溶液以誘導(dǎo)pH，C組大鼠一次性腹腔注射與M組等量生理鹽水和乙醇(8∶2)混合液，隨后兩組大鼠繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)20d。

5 檢 測

5.1 肺動(dòng)脈壓力的檢測： 飼養(yǎng)20d時(shí)，戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后，用充滿6250U/L肝素鹽水的硅膠管(外徑0.9mm，內(nèi)徑0.6mm) 經(jīng)頸外靜脈置管，一端插入右心室，另一端接壓力換能器并連入BL-420E 生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)記錄右心室收縮壓(Right ventricular systolic pressure，RVSP)[4]以間接反應(yīng)肺動(dòng)脈壓力。

5.2 MPs提取及測定 : 按文獻(xiàn)報(bào)道用兩步法提取MPs：血液先離心(4℃ 11000g 2min)獲得乏血小板血漿，然后取2ml乏血小板血漿移入1.5ml EP管后再第二次離心(4℃ 13000g 45min)后盡量吸去上清，MPs沉淀于EP管管底，向EP管內(nèi)加100μl RPMI 1640培養(yǎng)基并吹懸MPs。MPs的蛋白濃度用BCA試劑盒測定后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)(或放-80℃冰箱保存)。

5.3 肺動(dòng)脈舒張功能檢測：其余6只大鼠，行開胸取肺動(dòng)脈，立即置于預(yù)冷并灌注混合氣(95% CO2混合氣體)的K-H液中，小心剝離動(dòng)脈周圍結(jié)締組織，后將肺動(dòng)脈橫切為3～4 mm寬的血管環(huán)，然后將血管環(huán)移入盛有預(yù)先通氣、37±0.5℃的K-H液的浴皿中，小心將血管環(huán)套在浸泡在浴皿中的張力傳感裝置上，連接MD 2000生物信號(hào)采集系統(tǒng)。浴皿中持續(xù)通氣，保持恒溫，然后給予2g前負(fù)荷并讓血管環(huán)平衡60min，期間每間隔15min換1次K-H液。平衡結(jié)束后，加入KCl(浴皿濃度10-6mol/L)反復(fù)收縮3次，以檢測血管環(huán)的穩(wěn)定性。用K-H液洗脫KCl至基線后進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)：分別用等量的C組和M組的MPs(1mg/ml)孵育血管環(huán)30min后用NA(浴皿濃度10-6mol/L)收縮血管環(huán)至最大張力值(Vmax)，然后加入Ach(浴皿濃度10-7～10-4mol/L)并記錄不同Ach濃度的張力值(Vach)，測定舒張百分比：(Vmax-Vach)/Vmax。洗脫各種藥物后用L-NAME (100umol/L)孵育血管環(huán)30 min，再次用NA和ACh處理血管環(huán)以了解eNOS依賴的血管舒張功能。

結(jié) 果

1 RVSP測定 各組大鼠RVSP測量結(jié)果，見表1。

表1 各組RVSP (±s)

注：與C組比較，*P<0.05

2 MPs測定 各組大鼠MPs的測量結(jié)果，見表2。

表2 各組MPs(±s)

注：與C組比較，*P<0.05

3 血管舒張功能的測定 與C組比較(88.71±1.36)，M組(40.57±3.64)MPs損害了肺動(dòng)脈血管的舒張功能。L-NAME(eNOS的特異性抑制劑)同樣抑制了Ach舒張血管的功能，提示MPs損害肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮依賴的舒張功能。pH時(shí)，肺血管舒張功能受損可能是通過MPs實(shí)現(xiàn)的。

討 論

我國是煙草消費(fèi)大國，因此慢性支氣管炎、肺氣腫、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等慢性肺部疾病發(fā)病率明顯高于其他國家；支氣管擴(kuò)張、肺結(jié)核等長期病理刺激最后也會(huì)導(dǎo)致pH，并可引起右心衰竭。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：pH時(shí)大鼠體內(nèi)MPs含量升高，這些升高的MPs損害了內(nèi)皮依賴的舒張功能，進(jìn)而繼續(xù)加重pH從而形成一個(gè)惡性循環(huán)的病理生理過程。

MPs是機(jī)體在受到高切應(yīng)力、C 反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子等刺激時(shí)由血小板、內(nèi)皮細(xì)胞等以出芽方式分泌的亞微米級(jí)顆粒，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)MPs可以反映內(nèi)皮損傷和內(nèi)皮功能障礙[5]。Ci等[6]研究還發(fā)現(xiàn)MPs可減少內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的表達(dá)和一氧化氮(NO)的產(chǎn)生。我們最近的研究也發(fā)現(xiàn)pH大鼠體內(nèi)增高的MPs可以減少離體肺血管中eNOS的蛋白表達(dá)，增加elastin的表達(dá)。本研究顯示： pH大鼠MPs含量升高，而升高的MPs進(jìn)而損害內(nèi)皮依賴的離體大鼠肺動(dòng)脈血管的舒張功能。

肺血管的壓力由肺血管的收縮力和舒張力決定，而血管的收縮和舒張是由內(nèi)皮分泌的收縮因子和舒張因子之間的相互作用調(diào)控的，正常時(shí)二者處于穩(wěn)態(tài)。已有研究報(bào)道：肺血管的舒張因子主要是由eNOS產(chǎn)生的NO介導(dǎo)的。NO主要通過以下作用影響肺動(dòng)脈壓力：調(diào)節(jié)血管緊張度、抑制平滑肌細(xì)胞增殖和抑制血小板聚集。此研究發(fā)現(xiàn)來源于M組的MPs抑制了肺血管內(nèi)皮依賴的(由eNOS的特異性抑制劑L-NAME體現(xiàn))血管舒張功能，肺血管舒張功能的受損必將使肺血管壓力升高而加重pH病情。

綜上所述：pH時(shí)大鼠體內(nèi)的MPs含量升高，這些MPs可以損害肺血管內(nèi)皮依賴的舒張功能，進(jìn)而形成了：pH→ MPs →舒張功能受損→ pH加重的惡性循環(huán)。進(jìn)一步闡述了pH的發(fā)病機(jī)理，為將來尋找pH的防治策略提供了一定的理論基礎(chǔ)。

[1] 王群讓，王旭蘭，代曉霞. 精氨酸防治肺動(dòng)脈高壓的研究[J]. 陜西醫(yī)學(xué)雜志，2014，43(9):1115-1117.

[2] Wang JM, Huang Y J, Wang Y,etal. Increased circulating CD31+ / CD42 - microparticles are associated with im paired systemic artery elasticity in healthy subjects[J]. Am J Hypertens, 2007,20(9):957-964.

[3] Hugel B, Carmen M, Martinez MC,etal. Membrane microparticles: two sides of the coin[J]. Physiology，2005，20(1): 22-27.

[4] 常鳳軍，魏 偉，歐志君，等. 左旋精氨酸恢復(fù)eNOS和iNOS平衡并抑制肺動(dòng)脈高壓的研究[J].中華胸心血管外科雜志，2012，28(4):237-240.

[5] 王 妍,陶 軍,楊 震,等. 腫瘤壞死因子促進(jìn)內(nèi)皮微顆粒釋放的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中華心血管病雜志, 2005, 33(12): 1137- 1140.

[6] Ci HB, Ou ZJ, Chang FJ ,etal. Endothelial microparticles increase in mitral valve disease and impair mitral valve endothelial function[J]. American Journal of Physiology- Endocrinology and Metabolism. 2013，304(7):E695-702.

(收稿：2015-03-17)

*陜西省自然科學(xué)基金資助(2013JC-16)

肺動(dòng)脈 血管舒張 @循環(huán)微顆粒

R544

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.08.004

△陜西省人民醫(yī)院心血管內(nèi)二科

#通訊作者