牙鲆(Paralichthys olivaceus)浸泡免疫鰻弧菌(Vibrio anguillarum)滅活疫苗后11種免疫相關(guān)基因的表達(dá)變化*

邢 婧 王 洋 宋曉青 唐小千 繩秀珍 戰(zhàn)文斌

(中國海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物病害與免疫學(xué)研究室 青島 266003)

隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展, 構(gòu)建健康、無公害的養(yǎng)殖體系已經(jīng)成為一種趨勢, 接種疫苗是防治魚類細(xì)菌、病毒性疾病的有效方法(Ellis, 1988)。浸泡免疫方式接種疫苗具有省時(shí)省力、節(jié)約成本且對(duì)魚體刺激小等優(yōu)點(diǎn), 是疫苗接種最便捷的途徑。為研究免疫后魚體免疫系統(tǒng)的變化以及疫苗的接種效果, 常檢測一些非特異性指標(biāo)及特異性指標(biāo), 如魚類血清及黏液抗體水平變化(劉雨果等, 2011)、免疫相關(guān)酶活性(Danet al, 2013)、淋巴細(xì)胞數(shù)量(Tanget al, 2010)、呼吸爆發(fā)(Danet al, 2013)、補(bǔ)體活性(Danet al, 2013)等。近年來, 從基因水平對(duì)疫苗免疫效果進(jìn)行研究的報(bào)道越來越多, 有研究發(fā)現(xiàn), 哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)浸泡免疫斜帶石斑魚(Epinephelus coioide)后,MHCⅡ類分子在鰓、皮膚、頭腎、脾臟和后腸中表達(dá)量均有不同程度的上調(diào)(王慶等, 2010); 浸泡免疫鰻弧菌(Vibrio anguillarum)滅活疫苗后, 大菱鲆(Scophthalmus maximus)多聚免疫球蛋白受體(plgR)基因在皮膚、鰓、脾臟中有較高水平的上調(diào)表達(dá)(丁冰潔等, 2013)。虹鱒魚(Oncorhynchus mykiss)浸泡免疫魯氏耶爾森菌(Yersinia ruckeri)后血清淀粉樣蛋白A(SSA)、白介素(IL)8、腫瘤壞死因子(INF)α、Toll-like受體(TLR)5、T細(xì)胞表面標(biāo)志(TCR)β、IgT基因在脾臟中的表達(dá)量出現(xiàn)不同程度的上調(diào), 其中 SSA基因的上調(diào)最為顯著(Evenhuiset al, 2012); 浸泡免疫殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)后, 虹鱒魚鰓和腎中 IL-1β、IL-8、CD4、IgM 和 IgD基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢, IL-1β基因在腎臟中的表達(dá)量最高可達(dá)對(duì)照組的10倍(Cobo Labarcaet al, 2015)。這些研究結(jié)果均表明疫苗免疫能引起魚類諸多免疫相關(guān)基因的快速變化。但浸泡免疫后多組織多基因表達(dá)變化的研究還較少, 本文通過制備鰻弧菌全菌滅活疫苗, 將牙鲆經(jīng)浸泡免疫, 利用熒光定量PCR法研究免疫后牙鲆脾、頭腎、鰓3種組織中TLR2、TLR5M、髓樣分化因子MyD88、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)- κB、IL-6、IFNγ、趨化因子 CXC、補(bǔ)體 C3、HSP70、CD4、自然殺傷細(xì)胞增強(qiáng)因子(NKEF)十一種免疫相關(guān)基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化, 從基因水平探究浸泡免疫對(duì)牙鲆免疫應(yīng)答的影響, 篩選浸泡免疫效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

牙鲆購自山東日照某牙鲆養(yǎng)殖場, 體長為 10—13cm, 實(shí)驗(yàn)前將健康牙鲆在水槽中暫養(yǎng)1周, 水溫為20—22°C, pH為7.4—7.8, 期間連續(xù)充氣, 每天換水一次, 投喂標(biāo)準(zhǔn)飼料一次。

1.2 鰻弧菌全菌滅活疫苗的制備

鰻弧菌由本實(shí)驗(yàn)室保存, 將菌種接種于2216 E固體培養(yǎng)基中, 28°C培養(yǎng)24h, 挑取單菌落至2216 E液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)24h, 之后6000g4°C離心15min,去上清液, 無菌磷酸鹽緩沖液(PBS, pH 7.4)清洗沉淀3次, 最后以含0.5%甲醛(V/V)的PBS重懸, 4°C放置48h, 平板培養(yǎng)檢測無活菌存在, 再以PBS離心洗滌3次, 4°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 牙鲆的免疫及取樣

將暫養(yǎng)后的牙鲆隨機(jī)分為 2組, 每組 60尾。第一組浸泡于濃度為 1×108CFU/mL滅活疫苗菌液中,連續(xù)充氣浸泡30min; 第二組海水充氣浸泡30min作為對(duì)照。處理后于 0h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、7d、14d分別在各組隨機(jī)取3尾牙鲆, 分別取脾、頭腎、鰓3種組織, 同一時(shí)間點(diǎn)來源于3尾牙鲆同一組織的樣品混勻后用于檢測比較11種免疫相關(guān)基因表達(dá)的變化及差異。

1.4 RNA的提取及cDNA的合成

取各組織樣品約 20mg, 應(yīng)用 Trizol法提取總RNA, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性, 以微量核酸測定儀(NanoDrop 8000, Thermo, 美國)測定RNA的濃度和純度。提取的RNA利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems)經(jīng) RT-PCR 合成 cDNA。所得cDNA樣品–20°C保存, 備用。

1.5 熒光定量PCR所用引物的設(shè)計(jì)與驗(yàn)證

根據(jù)已知的牙鲆核糖體RNA(18S RNA)、TLR2、TLR5M、MyD88、NF-κB、IL-6、IFNγ、CXC、C3、HSP70、CD4、NKEF基因序列, 采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)各基因特異性引物, 隨機(jī)選取對(duì)照組的脾、頭腎、鰓的cDNA樣品, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測, 選擇產(chǎn)物為單一條帶的引物, 利用SYBR?Premix Ex Taq 試劑盒(Takara, 美國)在熒光定量 PCR 儀(Light Cycler?480 PCR, Roche,Ⅱ

德國)上

進(jìn)行擴(kuò)增, 最終以擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的溶解曲線是單一波峰的引物作為熒光定量PCR的特異性引物。

1.6 熒光定量PCR檢測

采用微量核酸測定儀測定所有取樣組織 cDNA樣品的濃度, 用 DEPC水(焦碳酸二乙酯滅菌水)調(diào)整所有組織cDNA濃度統(tǒng)一為0.05μg/μL, 以18S RNA為內(nèi)參, 利用SYBR?Premix Ex Taq試劑盒在Light Cycler?480ⅡPCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增, 擴(kuò)增體系為 20μL,即: 模板 cDNA 2μL, 正反向引物各 0.4μL(引物濃度為 10μmol/L), 反應(yīng)混合液 10μL, 無菌水 7.2μL。為減小系統(tǒng)誤差每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn), 擴(kuò)增的條件為: 95°C 30s, 1 個(gè)循環(huán); 95°C 10s, 60°C 30s, 45 個(gè)循環(huán);95°C 5s, 60°C 1min, 95°C 5s, 1 個(gè)循環(huán); 40°C 冷卻。再次確認(rèn)每個(gè)樣品擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的溶解曲線是單一波峰, 并獲取Ct值(循環(huán)閾值), 用于數(shù)據(jù)處理及分析。

1.7 數(shù)據(jù)處理及分析

熒光定量 PCR 所得數(shù)據(jù)按照 2?ΔΔCt法(紀(jì)冬等,2009)進(jìn)行處理, 所有數(shù)值均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示。利用Origin 8.0軟件作圖, SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析, 采用 T-檢驗(yàn)分析不同時(shí)間點(diǎn)基因表達(dá)量的差異, 以P<0.05作為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光定量PCR所用引物的獲得

經(jīng)過常規(guī)PCR-瓊脂糖凝膠電泳及熒光定量PCR溶解曲線驗(yàn)證, 最終獲得11種基因以及18S RNA內(nèi)參的特異性引物, 各基因引物名及引物序列、退火溫度等信息見表1。應(yīng)用特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR,所有檢測樣品的擴(kuò)增結(jié)果均為單一產(chǎn)物。

表1 熒光定量PCR所用引物Tab.1 Primers used in quantitative real-time PCR

2.2 TLR2在脾臟、頭腎和鰓中的表達(dá)

脾臟中, TLR2基因的表達(dá)量自12h起顯著高于對(duì)照組, 48h達(dá)到最高值, 是對(duì)照組的12.15倍, 而后逐漸下降, 至14d時(shí)降至與對(duì)照組無顯著差異(圖1a);頭腎中, TLR2基因的表達(dá)量自4h起顯著高于對(duì)照組,48h達(dá)到最高值, 是對(duì)照組的 5.40倍, 而后逐漸下降,至14d與對(duì)照組無顯著差異(圖1b); 鰓中, TLR2自4h起顯著高于對(duì)照組, 之后快速上升, 24h達(dá)到最高值,是對(duì)照組的3.66倍, 之后逐漸下降, 至14d時(shí)與對(duì)照組無顯著差異(圖1c)。

2.3 TLR5M在脾臟、頭腎和鰓中的表達(dá)

圖1 鰻弧菌滅活疫苗免疫后牙鲆脾(a)、頭腎(b)、鰓(c)中TLR2相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Expression of TLR2 in spleen (a), head kidney (b) and gills (c) post immunization with formalin inactivated V. anguillarum“*”表示該浸泡組與對(duì)照組之間有顯著差異(P<0.05)

在脾臟中, TLR5M基因的表達(dá)量雖然略有變化,但相對(duì)于對(duì)照組變化不顯著(圖2a); 頭腎中, TLR5M基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組也無顯著變化(圖 2b); 鰓中,

TLR5M基因的表達(dá)呈現(xiàn)顯著上調(diào), 表達(dá)量自8h起顯著高于對(duì)照組, 24h達(dá)到最高值, 是對(duì)照組的2.75倍, 而后逐漸下降, 至 7d時(shí)降至與對(duì)照組無顯著差異(圖 2c)。

圖2 鰻弧菌滅活疫苗免疫后牙鲆脾(a)、頭腎(b)、鰓(c)中TLR5M相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Expression of TLR5M in spleen (a), head kidney (b) and gills (c) post immunization with formalin inactivated V. anguillarum“*”表示該浸泡組與對(duì)照組之間有顯著差異(P<0.05)

2.4 MyD88在脾臟、頭腎和鰓中的表達(dá)

脾臟中, MyD88基因的表達(dá)量自12h起顯著高于對(duì)照組, 48h達(dá)到最高值, 是對(duì)照組的 4.82倍, 而后逐漸下降, 至7d時(shí)降至與對(duì)照組無顯著差異(圖3a);頭腎中, MyD88基因的表達(dá)量自24h起顯著高于對(duì)照組, 48h達(dá)到最高值, 是對(duì)照組的 3.04倍, 之后維持在較高水平, 96h后逐漸下降, 至14d時(shí)降至與對(duì)照組無顯著差異(圖3b); 鰓中, MyD88基因的表達(dá)量自4h起顯著高于對(duì)照組, 略有下降后再次上升, 48h達(dá)到最高值, 是對(duì)照組的 2.58倍, 之后逐漸下降, 至 14d時(shí)與對(duì)照組無顯著差異(圖3c)。

2.5 NF-κB在脾臟、頭腎和鰓中的表達(dá)

圖3 鰻弧菌滅活疫苗免疫后牙鲆脾(a)、頭腎(b)、鰓(c)中MyD88相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Expression of MyD88 in spleen (a), head kidney (b) and gills (c) post immunization with formalin inactivated V. anguillarum“*”表示該浸泡組與對(duì)照組之間有顯著差異(P<0.05)

圖4 鰻弧菌滅活疫苗免疫后牙鲆脾(a)、頭腎(b)、鰓(c)中NF-κB相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Expression of NF-κB in spleen (a), head kidney (b) and gills (c) post immunization with formalin inactivated V. anguillarum“*”表示該浸泡組與對(duì)照組之間有顯著差異(P<0.05)

脾臟中, NF-κB基因的表達(dá)量自4h起顯著高于對(duì)照組, 24h達(dá)到最高值, 是對(duì)照組的10.43倍, 而后逐漸下降, 至 14d時(shí)降至與對(duì)照組無顯著差異(圖 4a);頭腎中, NF-κB基因的表達(dá)量自4h起顯著高于對(duì)照組,24h達(dá)到最高值, 是對(duì)照組的8.33倍, 而后逐漸下降,至 7d時(shí)降至與對(duì)照組無顯著差異(圖 4b); 鰓中,NF-κB基因的表達(dá)量自4h起顯著高于對(duì)照組, 24h達(dá)到最高值, 是對(duì)照組的 2.04倍, 之后逐漸下降, 至72h時(shí)與對(duì)照組無顯著差異(圖4c)。

2.6 CD4在脾臟、頭腎和鰓中的表達(dá)

脾臟中, CD4表達(dá)量自免疫后12h開始出現(xiàn)顯著高于對(duì)照組, 至 96h達(dá)到峰值, 為對(duì)照組的 6.62倍,之后呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(圖5a); 頭腎中, CD4基因的表達(dá)量自 8h起顯著高于對(duì)照組, 72h達(dá)到最高值,是對(duì)照組的 6.25倍, 而后逐漸下降(圖 5b); 鰓中,CD4基因的表達(dá)量自8h起顯著高于對(duì)照組, 72h達(dá)到最高值, 是對(duì)照組的 2.15倍, 之后逐漸下降, 至 14d時(shí)降至與對(duì)照組無顯著差異(圖5c)。

2.7 IL-6在脾臟、頭腎和鰓中的表達(dá)

脾臟中, IL-6基因的表達(dá)量自4h起顯著高于對(duì)照組, 24h達(dá)到最高值, 是對(duì)照組的10.65倍, 而后逐漸下降, 至7d時(shí)降至與對(duì)照組無顯著差異(圖6a); 頭腎中, IL-6基因的表達(dá)量自8h起顯著高于對(duì)照組, 24h達(dá)到最高值, 是對(duì)照組的7.93倍, 而后逐漸下降, 至7d時(shí)降至與對(duì)照組無顯著差異(圖6b); 鰓中, IL-6基因的表達(dá)量自4h起顯著高于對(duì)照組, 24h達(dá)到最高值,是對(duì)照組的10.42倍, 之后逐漸下降, 至7d時(shí)與對(duì)照組無顯著差異(圖6c)。

圖5 鰻弧菌滅活疫苗免疫后牙鲆脾(a)、頭腎(b)、鰓(c)中CD4相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Expression of CD4 in spleen (a), head kidney (b) and gills (c) post immunization with formalin inactivated V. anguillarum“*”表示該浸泡組與對(duì)照組之間有顯著差異(P<0.05)

圖6 鰻弧菌滅活疫苗免疫后牙鲆脾(a)、頭腎(b)、鰓(c)中IL-6相對(duì)表達(dá)量Fig. 6 Expression of IL-6 in spleen (a), head kidney (b) and gills (c) post immunization with formalin inactivated V. anguillarum“*”表示該浸泡組與對(duì)照組之間有顯著差異(P<0.05)

2.8 IFNγ在脾臟、頭腎和鰓中的表達(dá)

IFNγ基因在脾臟和頭腎 2種組織中的表達(dá)均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。脾臟中, IFNγ基因的表達(dá)量自8h起顯著高于對(duì)照組, 24h達(dá)到最高值, 是對(duì)照組的 2.76倍, 而后逐漸下降, 48h出現(xiàn)小幅度上調(diào), 至7d時(shí)降至與對(duì)照組無顯著差異(圖7a); 頭腎中, IFNγ基因的表達(dá)量自4h起顯著高于對(duì)照組, 48h達(dá)到最高值, 是對(duì)照組的 3.77倍, 而后逐漸下降, 96h時(shí)與對(duì)照組無顯著差異, 而后出現(xiàn)短暫的上升, 至14d時(shí)降至與對(duì)照組無顯著差異(圖7b); 鰓中, IFNγ基因的表達(dá)量自8h起顯著高于對(duì)照組, 之后快速上升, 24h達(dá)到最高值, 是對(duì)照組的 2.30倍, 之后逐漸下降, 至14d時(shí)與對(duì)照組無顯著差異(圖7c)。

2.9 CXC在脾臟、頭腎和鰓中的表達(dá)

脾臟中, CXC基因的表達(dá)量自8h起顯著高于對(duì)照組, 48h達(dá)到最高值, 是對(duì)照組的 3.28倍, 而后逐漸下降, 至7d時(shí)降至與對(duì)照組無顯著差異(圖8a); 頭腎中, CXC基因的表達(dá)量自 48h起顯著高于對(duì)照組,72h達(dá)到最高值, 是對(duì)照組的3.33倍, 而后逐漸下降,至 14d時(shí)降至與對(duì)照組無顯著差異(圖 8b); 鰓中,CXC基因的表達(dá)量自8h起顯著高于對(duì)照組, 48h達(dá)到最高值, 是對(duì)照組的 3.19倍, 之后逐漸下降, 至 14d時(shí)與對(duì)照組無顯著差異(圖8c)。

圖7 鰻弧菌滅活疫苗免疫后牙鲆脾(a)、頭腎(b)、鰓(c)中IFNγ相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Expression of IFNγ in spleen (a), head kidney (b) and gills (c) post immunization with formalin inactivated V. anguillarum“*”表示該浸泡組與對(duì)照組之間有顯著差異(P<0.05)

圖8 鰻弧菌滅活疫苗免疫后牙鲆脾(a)、頭腎(b)、鰓(c)中CXC相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Expression of CXC in spleen (a), head kidney (b) and gills (c) post immunization with formalin inactivated V. anguillarum“*”表示該浸泡組與對(duì)照組之間有顯著差異(P<0.05)

2.10 C3在脾臟、頭腎和鰓中的表達(dá)

免疫后C3在脾臟、頭腎和鰓組織中的表達(dá)量均有上調(diào), 但上調(diào)幅度都較低, 峰值是對(duì)照組的3倍左右。脾臟中, 自8h起顯著高于對(duì)照組, 48h達(dá)到最高值, 為對(duì)照組的2.52倍, 而后有所下降, 7—14d時(shí)又出現(xiàn)小幅度上調(diào)表達(dá)(圖9a); 頭腎中, C3的表達(dá)量自4h起顯著高于對(duì)照組, 48h達(dá)到最高值, 為對(duì)照組的3.71倍, 而后逐漸下降, 至14d與對(duì)照組無顯著差異(圖9b); 鰓中, C3的表達(dá)量自8h起顯著高于對(duì)照組,48h達(dá)到最高值, 為對(duì)照組的2.73倍, 之后逐漸下降,至7d與對(duì)照組無顯著差異(圖9c)。

圖9 鰻弧菌滅活疫苗免疫后牙鲆脾(a)、頭腎(b)、鰓(c)中C3相對(duì)表達(dá)量Fig.9 Expression of C3 in spleen (a), head kidney (b) and gills (c) post immunization with formalin inactivated V. anguillarum“*”表示該浸泡組與對(duì)照組之間有顯著差異(P<0.05)

2.11 HSP70在脾臟、頭腎和鰓中的表達(dá)

脾臟中, HSP70基因的表達(dá)量自 4h起顯著高于對(duì)照組, 24h達(dá)到最高值, 是對(duì)照組的 7.69倍, 而后逐漸下降, 至7d時(shí)降至與對(duì)照組無顯著差異(圖10a);頭腎中, HSP70基因的表達(dá)量自 8h起顯著高于對(duì)照組, 24h達(dá)到最高值, 是對(duì)照組的 4.67倍, 而后逐漸下降, 至14d時(shí)降至與對(duì)照組無顯著差異(圖10b); 鰓中, HSP70基因的表達(dá)量自 4h起顯著高于對(duì)照組,24h達(dá)到最高值, 是對(duì)照組的9.65倍, 之后逐漸下降,至7d時(shí)降至與對(duì)照組無顯著差異(圖10c)。

圖10 鰻弧菌滅活疫苗免疫后牙鲆脾(a)、頭腎(b)、鰓(c)中HSP70相對(duì)表達(dá)量Fig.10 Expression of HSP70 in spleen (a), head kidney (b) and gills (c) post immunization with formalin inactivated V. anguillarum“*”表示該浸泡組與對(duì)照組之間有顯著差異(P<0.05)

2.12 NKEF在脾臟、頭腎和鰓中的表達(dá)

脾臟中, NKEF基因的表達(dá)量自8h起顯著高于對(duì)照組, 24h達(dá)到最高值, 是對(duì)照組的3.11倍, 而后逐漸下降, 至 7d時(shí)恢復(fù)對(duì)照組水平(圖 11a); 頭腎中, NKEF基因的表達(dá)量自 4h起顯著低于對(duì)照組,48h達(dá)到最低值, 是對(duì)照組的 0.49倍, 而后逐漸上調(diào)(圖 11b); 鰓中, NKEF基因的表達(dá)量自4h起顯著高于對(duì)照組, 24h達(dá)到最高值, 是對(duì)照組的 4.39倍, 之后逐漸下降, 至 14d時(shí)與對(duì)照組無顯著差異(圖 11c)。

圖11 鰻弧菌滅活疫苗免疫后牙鲆脾(a)、頭腎(b)、鰓(c)中NKEF相對(duì)表達(dá)量Fig.11 Expression of NKEF in spleen (a), head kidney (b) and gills (c) post immunization with formalin inactivated V. anguillarum“*”表示該浸泡組與對(duì)照組之間有顯著差異(P<0.05)

3 討論

3.1 11種基因表達(dá)量變化的總體趨勢

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 浸泡免疫方式能引起牙鲆 11種免疫相關(guān)基因在三種組織中的顯著上調(diào)或下調(diào)表達(dá)。TLR2、TLR5M、NF-κB和MyD88是TLR信號(hào)通路的關(guān)鍵分子, TLR2可識(shí)別合成的三酰脂肽Pam3CSK4和革蘭氏陽性細(xì)菌的脂肽(Weiet al, 2011);在哺乳動(dòng)物中, 膜結(jié)合的TLR5可以識(shí)別細(xì)菌的鞭毛蛋白成分, TLR5M基因依賴MyD88途徑激活鞭毛介導(dǎo)的 NF-κB, 之后誘導(dǎo)前炎性細(xì)胞因子(白細(xì)胞介素和腫瘤壞死因子等)和I型干擾素的產(chǎn)生(Hwanget al,2010), 由 I型干擾素介導(dǎo)直接的防御反應(yīng), 而 MyD88是除TLR3以外所有TLRs的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子(Tanget al,2012)。CD4是T細(xì)胞重要的表面分子, CD4+T細(xì)胞具有輔助性T細(xì)胞的功能, 是MHCⅡ類分子的受體,在機(jī)體特異性免疫識(shí)別外源性抗原中具有重要意義(Katoet al, 2013)。IL-6是由輔助性T細(xì)胞分泌的一種多效的細(xì)胞因子, 有效促進(jìn)B細(xì)胞的增殖分化和T細(xì)胞的成熟, 在非特異性及特異性免疫應(yīng)答中都能發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用, 在炎癥反應(yīng)的早期即可大量表達(dá)(Nakaet al, 2002)。IFNγ屬于Ⅱ型干擾素, 除具有抗病毒、抗增殖活性外, 其主要生物學(xué)活性為免疫調(diào)節(jié)作用(Yanget al, 2013)。HSP70可作為分子伴侶,參與蛋白質(zhì)代謝, 協(xié)助蛋白質(zhì)折疊、組裝及轉(zhuǎn)運(yùn), 并能降解錯(cuò)誤裝配的蛋白質(zhì)等, 它的表達(dá)受外界環(huán)境及機(jī)體自身變化的調(diào)控, 能夠在外源病原體刺激機(jī)體時(shí)發(fā)揮應(yīng)激作用(Cuiet al, 2011)。CXC能夠募集免疫細(xì)胞遷移, 在炎性反應(yīng)及病原侵染中發(fā)揮重要作用。C3是存在于血清中的具有非特異性抵抗作用的體液分子, 是補(bǔ)體活化途徑的重要因子, 發(fā)揮直接的抗微生物作用和調(diào)理作用, 在魚類免疫防御機(jī)制中發(fā)揮著重要作用(陳勇等, 2008)。NKEF最初在人類紅細(xì)胞中克隆得到, 是一種可溶性因子, 屬于一個(gè)保守的Prx基因家族, 從原核生物到高等哺乳動(dòng)物中均有發(fā)現(xiàn), 它可以增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性活動(dòng), 從而促進(jìn)機(jī)體非特異性免疫的發(fā)生(孫晶等, 2014)。本研究發(fā)現(xiàn), 所研究的11種基因中, TLR2、MyD88、NF-κB、IL-6、IFNγ、CXC、C3 、HSP-70 和 CD4九種基因呈現(xiàn)了上調(diào)表達(dá)趨勢, 表達(dá)量峰值出現(xiàn)在免疫后24—96h, 為對(duì)照組的 2—12倍。說明這些基因通過快速大量的表達(dá)參與牙鲆的免疫應(yīng)答。

3.2 C3、TLR5M、NKEF三種基因的表達(dá)變化

有研究發(fā)現(xiàn), 南亞野鯪(Labeo rohita)經(jīng)遲純愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)免疫后, C3基因在腎組織中的表達(dá)量呈顯著上調(diào)的趨勢(Mohantyet al, 2010),本實(shí)驗(yàn)上調(diào)表達(dá)的基因中, C3的表達(dá)存在其獨(dú)特性,C3在 3種組織中的表達(dá)上調(diào)呈現(xiàn)出雙波峰現(xiàn)象, 第一次峰值出現(xiàn)在免疫后48h, 在14d時(shí)出現(xiàn)第二次峰值, 但低于48h時(shí)。結(jié)合補(bǔ)體的活化機(jī)制推斷, 第一個(gè)峰值的出現(xiàn)可能與浸泡免疫后疫苗直接刺激機(jī)體使C3基因大量表達(dá)以發(fā)揮其直接的抗微生物作用有關(guān); 基因的第二次上調(diào)表達(dá)可能與補(bǔ)體系統(tǒng)的激活有關(guān), 機(jī)體受到抗原刺激后啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答, 漿細(xì)胞分泌IgM到血液、黏液中, 形成抗原抗體復(fù)合物,進(jìn)而激活補(bǔ)體活化途徑。

本研究中, 免疫后TLR5M基因表達(dá)量在脾臟和頭腎中與對(duì)照組無顯著差異, 在鰓中呈現(xiàn)上調(diào)趨勢,為對(duì)照組的2.75倍。結(jié)合之前的相關(guān)報(bào)道, 鰻弧菌及其鞭毛刺激虹鱒細(xì)胞系后 TLR5M 表達(dá)變化不顯著,而TLR5S顯著上調(diào)(Tsujitaet al, 2004)。推斷TLR5M在消化道的細(xì)菌識(shí)別中發(fā)揮重要作用而在其他器官作用不顯著, 且TLR5M與TLR5S識(shí)別鞭毛的成分有可能不同, 導(dǎo)致其表達(dá)出現(xiàn)差異。鰓中TLR5M基因的上調(diào)表達(dá)可能與浸泡免疫時(shí)病原直接接觸到鰓組織, 短時(shí)間內(nèi)引起了TLR5M的應(yīng)激表達(dá)有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn), 鯉魚(Cyprinus carpioL.)注射感染鯉春病毒(Spring Viraemia of Carp Virus)后, 脾臟和鰓組織中的 NKEF-B基因的表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組顯著上調(diào), 而頭腎中 NKEF-B基因的表達(dá)量顯著下調(diào)(Huanget al, 2009)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 牙鲆浸泡免疫鰻弧菌滅活疫苗后, NKEF基因的表達(dá)量在脾臟和鰓組織中顯著上調(diào), 而在頭腎中顯著下調(diào), 表達(dá)量最小值為對(duì)照組的 0.49倍, 與之前的研究結(jié)果一致, 推測NKEF基因在機(jī)體非特異性免疫防御中可能起重要作用, 頭腎作為魚類主要的造血和淋巴器官, 它在受到外來抗原的刺激時(shí)會(huì)將產(chǎn)生的血細(xì)胞和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到血液及其它組織中, 這也許是造成NKEF基因在頭腎中下調(diào)表達(dá)的原因, 但詳細(xì)的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3.3 11種基因表達(dá)變化的組織差異性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 在脾臟和頭腎中, TLR2、NF-κB、和 CD4基因的表達(dá)峰值高于鰓; 在脾臟和鰓中,IL-6、HSP70和 NKEF基因的表達(dá)峰值均高于脾臟;TLR5M、MyD88、IFNγ、CXC和C3基因在三個(gè)組織中的表達(dá)峰值差異不大; 在三個(gè)組織中每個(gè)基因表達(dá)峰值出現(xiàn)的時(shí)間基本一致。結(jié)合之前的研究結(jié)果, 注射免疫后脾臟和頭腎中免疫相關(guān)基因的表達(dá)量均顯著高于鰓, 且表達(dá)量峰值出現(xiàn)的時(shí)間早于鰓(宋曉青等, 2014), 推測浸泡免疫可以迅速啟動(dòng)魚類的黏膜免疫, 使鰓組織中免疫相關(guān)基因表達(dá)量上調(diào)。因此, 在評(píng)價(jià)疫苗浸泡免疫效果時(shí), 除檢測脾臟和頭腎等主要的免疫器官外, 鰓也是需要檢測的組織。

本文通過比較免疫后11種基因在三種組織中的表達(dá)量變化趨勢, 發(fā)現(xiàn)IL-6和HSP70基因在三種組織中的表達(dá)量上調(diào)峰值較高, 為對(duì)照組的 5—11倍,且變化較為迅速, 4h即出現(xiàn)顯著上調(diào), 在24h達(dá)到峰值。有研究也發(fā)現(xiàn), 鰻弧菌感染金頭鯛(Sparus aurata)后, IL-6基因在4h內(nèi)即呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)(Castellanaet al,2008); 海豚鏈球菌(GIFTStrepstococcus iniae)免疫吉富羅非魚(Oreochromis niloticus)后, HSP70基因表達(dá)量在48h之內(nèi)上調(diào)至對(duì)照組的5倍多(王瑞等, 2010)。由此可見, IL-6和HSP70基因在浸泡免疫滅活疫苗后是較為敏感的因子, 可以作為疫苗浸泡免疫后的效果評(píng)價(jià)指標(biāo)。

4 結(jié)論

浸泡免疫后, 鰻弧菌滅活疫苗有效引起了牙鲆的特異性和非特異性免疫應(yīng)答反應(yīng), 各免疫相關(guān)基因在脾臟、頭腎和鰓三種組織中出現(xiàn)了不同程度的上調(diào)或下調(diào)表達(dá), 其中IL-6和HSP70基因在三個(gè)組織中均表達(dá)變化迅速, 表達(dá)豐度較高, 可以作為浸泡免疫后免疫效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)。在監(jiān)測浸泡免疫效果時(shí),除脾臟和頭腎外, 鰓也是重要的檢測組織。

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