一株海洋生境芽孢桿菌FA08的篩選、鑒定及其酶學(xué)特性和抗菌性能分析*

方衛(wèi)東 唐 旭 劉源森 林 凌 黃仕新 高培麗 徐長(zhǎng)安①

(1. 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 廈門(mén) 361021; 2. 福建省海新集團(tuán)有限公司 漳州 363102; 3. 國(guó)家海洋局第三海洋研究所 廈門(mén) 361005)

隨著健康養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展, 有益微生物的應(yīng)用越來(lái)越廣泛, 如在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中, 使用光合細(xì)菌、枯草芽孢桿菌等微生物制劑改善養(yǎng)殖環(huán)境, 降低疾病的發(fā)生, 取得了較好的效果(Vanittanakomet al, 1986;Burgesset al, 1993; Barsbyet al, 2001; Vaseeharanet al, 2003; 顧繼銳等, 2011; 張慶華等, 2011; 高存川等,2012; 潘娟等, 2012; 張峰峰等, 2012); 通過(guò)篩選生防細(xì)菌, 利用生防細(xì)菌對(duì)水產(chǎn)病原菌的抑制作用, 尋找替代抗生素的新途徑, 如從高度污染的海灘污泥中, 分離得到一株枯草芽孢桿菌 LHB02對(duì)三種弧菌包括哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和鰻弧菌(Vibrio anguillarum)都有很強(qiáng)的抑制作用(徐長(zhǎng)安等, 2011); 從不同生長(zhǎng)階段的對(duì)蝦腸道中分離對(duì)病原菌(鰻弧菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌)有拮抗作用的細(xì)菌(李海兵等, 2008)。另外專家學(xué)者也開(kāi)展了利用益生菌、酶制劑促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的健康和提高飼料利用率方面的研究(Tamehiroet al, 2002; Liuet al, 2010), 并取得了很好的試驗(yàn)效果,如芽孢桿菌、低聚木糖、復(fù)合酶制劑及它們的配伍物可以促進(jìn)異育銀鯽的生長(zhǎng), 提高飼料利用率, 促進(jìn)腸道有益微生物的生長(zhǎng)和抑制有害微生物, 并且能提高肝胰臟蛋白酶mRNA表達(dá)量和腸道酶活性(劉文斌等, 2007); 在飼料中添加糞腸球菌能夠促進(jìn)羅非魚(yú)生長(zhǎng), 提高飼料利用率, 降低血清膽固醇和甘油三酯含量以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性, 同時(shí)增加腸道乳酸菌數(shù)量,改善腸道微環(huán)境(周曉波等, 2014); 纖維素酶可降低動(dòng)物胃腸內(nèi)容物的粘稠度, 促進(jìn)內(nèi)源酶的擴(kuò)散, 提高養(yǎng)分的消化吸收(胡喜峰等, 2004); 飼料中添加纖維素酶, 草魚(yú)增重率提高, 餌料系數(shù)降低, 干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪和粗纖維消化率都提高, 體成分沒(méi)有顯著變化(高春生等, 2006)。

目前, 同時(shí)具有產(chǎn)酶和抗菌性能的功能菌株篩選報(bào)道較少, 本實(shí)驗(yàn)室在前期的功能菌篩選中, 篩選到一株既產(chǎn)纖維素酶又具有拮抗水產(chǎn)病原菌的芽孢桿菌, 本研究報(bào)道了該功能菌的篩選、鑒定, 及對(duì)功能菌產(chǎn)生的纖維素酶進(jìn)行耐溫、耐酸堿和對(duì)紫外線的穩(wěn)定性進(jìn)行考察, 并開(kāi)展功能菌對(duì)水產(chǎn)常見(jiàn)病原菌的拮抗效果分析, 初步評(píng)估該功能菌株的價(jià)值, 為以后開(kāi)發(fā)該菌株提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

用于篩菌的樣品采自福建省寧德市養(yǎng)殖池底泥。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基: 蛋白胨10g, 酵母提取物5g, 氯化鈉10g, 水 1000 mL, pH 7.2—7.4。

SLB培養(yǎng)基: 蛋白胨10g, 酵母提取物 5g, 氯化鈉 10g, 瓊脂20g, 水1000 mL, pH 7.2—7.4。

產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基: 蛋白胨 9.0 g、酵母膏 10.0 g,羧甲基纖維素鈉 5.0 g, 水1000 mL。

CMC-Na平板: 羧甲基纖維素鈉15.0 g、硫酸銨1.0 g、酵母膏1.0 g、硫酸鎂1.0 g、磷酸二氫鉀1.0 g、瓊脂20.0 g、水1000 mL, pH為自然值。

1.3 測(cè)試菌

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila), 愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella), 哈維氏弧菌(Vibrio harveyi), 溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus), 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus), 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。

1.4 儀器設(shè)備

常規(guī)玻璃器皿、電子天平、超凈工作臺(tái)、打孔器、移液槍、臺(tái)式搖床、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱,PCR儀, 核酸電泳儀, 凝膠成像儀, 多功能酶標(biāo)儀和手提式紫外反射儀等。

1.5 功能菌的篩選

1.5.1 目標(biāo)菌的分離 取 10g污泥樣品, 加入100mL 0.85% NaCl中, 攪拌后取上層濁液置于LB培養(yǎng)基, 37°C, 180 r/min, 富集培養(yǎng) 30h后, 菌液置于75°C水浴20min。水浴后的菌液進(jìn)行梯度稀釋及平板涂布法進(jìn)行分離。

1.5.2 功能菌產(chǎn)纖維素酶檢測(cè) 分別挑取初篩得到的目標(biāo)菌, 標(biāo)示為: FA01、FA02、FA03、FA04、FA05、FA06、FA07、FA08、FA09、FA10 等以此類推, 將這些目標(biāo)菌置于LB培養(yǎng)基中, 37°C, 180 r/min,活化6 h, 活化好的菌液按10%接種至產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基, 37°C, 180 r/min, 發(fā)酵 48h 后, 10000 r/min, 離心 6min, 棄去沉淀, 得上清液, 為粗酶液; 采用CMC-Na平板, 打孔后, 孔內(nèi)添加 50μL所得的上清液, 之后置于 37°C過(guò)夜; 反應(yīng)后的平板用剛果紅染色1h, 接著用0.85% NaCl脫色, 觀察是否出現(xiàn)水解圈,出現(xiàn)水解圈的即定為功能菌。每株菌做三個(gè)重復(fù)。

1.6 功能菌的鑒定

參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠等, 2001)進(jìn)行功能菌生物學(xué)特征觀察和生理生化試驗(yàn), 并結(jié)合16S rDNA序列分析方法進(jìn)行鑒定。

1.6.1 生物學(xué)特征觀察 將功能菌接種至 SLB培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平板, 放入溫度設(shè)置為 37°C的恒溫箱中, 培養(yǎng)24 h, 觀察菌落形態(tài)特征。

1.6.2 生理生化試驗(yàn) 進(jìn)行功能菌部分生理生化試驗(yàn), 包括D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇的產(chǎn)酸試驗(yàn); 接觸酶、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)、明膠、淀粉、酪氨酸水解試驗(yàn); V-P測(cè)定、吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)、利用檸檬酸鹽試驗(yàn)。

1.6.3 16S rDNA序列分析 參照文獻(xiàn)(徐長(zhǎng)安等,2011), 采用磁珠法基因組DNA抽提試劑盒提取功能菌全基因組。以全DNA為模板, 使用細(xì)菌16S rDNA通用引物, 27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和 1492R: 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。用 Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增, PCR程序?yàn)? 94°C預(yù)變性 4min; 94°C 45s, 55°C 45s, 72°C 1 min, 30 個(gè)循環(huán);72°C 10 min 修復(fù)延伸; 4°C ∞終止反應(yīng)。使用 SanPreP柱式 DNA膠回收試劑盒純化 PCR產(chǎn)物。純化后的PCR產(chǎn)物送至上海生工測(cè)序。將測(cè)得的16S rDNA序列輸入www.ncbi.nlm.nih.gov Blast進(jìn)行同源性搜索,選取其中與之同源性較高的菌株, 用 MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析, 構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.7 酶活特性分析

接種功能菌株至LB培養(yǎng)基中, 37°C, 180 r/min,活化6h, 活化好的菌液按10% 接種至產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基, 37°C, 180 r/min, 發(fā)酵 24h 后, 10000 r/min, 離心6min, 棄去沉淀, 得上清液, 為粗酶液。參照文獻(xiàn)(韓銘等, 2012; 于嵐等, 2013), 采用3, 5-二硝基水楊酸比色定糖法(DNS)進(jìn)行酶活測(cè)定, 分別考察功能菌株所產(chǎn)的纖維素酶對(duì)溫度、pH值和紫外線的耐受能力。

1.7.1 酶對(duì)pH值的耐受能力檢測(cè) 粗酶液在不同pH緩沖液(3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0)混合均勻, 置于37°C, 處理1h, 測(cè)定殘存酶活, 以最高酶活為100%。

1.7.2 酶對(duì)溫度的耐受能力檢測(cè) 粗酶液分別在溫度為 30、40、50、60、70、80°C的水浴鍋中處理1h后, 測(cè)定殘存酶活, 以最高酶活為100%。1.7.3 紫外線對(duì)酶活性的影響 粗酶液分別在紫外線波長(zhǎng)365nm, 距離10cm下照射10、20、30、40、50、60 min后, 測(cè)定殘存酶活, 以最高酶活為100%。

1.8 拮抗性能檢測(cè)

1.8.1 抑菌板的制作 選擇嗜水氣單胞菌、愛(ài)德華氏菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌, 用接種環(huán)刮下菌體接種至裝有5mL LB培養(yǎng)基的試管中, 放入溫度設(shè)置為37°C, 轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床中培養(yǎng)16h后, 取1 mL的培養(yǎng)液至100 mL的45—50°C的 SLB培養(yǎng)基中, 迅速搖勻倒板, 待凝固后用打孔器打孔。

1.8.2 發(fā)酵上清的制備 功能菌FA08斜面接種至裝有5mL LB培養(yǎng)基的試管中, 放入溫度設(shè)置為37°C,轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床中活化6 h后, 按10%的接種量至裝有50 mL LB培養(yǎng)基的三角瓶中, 放入溫度設(shè)置為 37°C, 轉(zhuǎn)速為 180 r/min的搖床中發(fā)酵 17 h,10000 r/min 離心6 min, 得發(fā)酵上清。

1.8.3 采用瓊脂擴(kuò)散法(agar diffusion method)進(jìn)行測(cè)定(Tagget al, 1971)。通過(guò)測(cè)量圓形的透明帶(抑菌圈)直徑的大小來(lái)表示發(fā)酵上清液抑菌活性的強(qiáng)弱。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)菌篩選結(jié)果

經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 標(biāo)識(shí)為 FA08的菌株, 三個(gè)重復(fù)均出現(xiàn)水解圈, 如圖1所示, 而其它菌株未出現(xiàn)水解圈,因此 FA08為目標(biāo)功能菌。

圖1 功能菌FA08水解圈Fig.1 The hydrolysis circle of strain FA08

2.2 功能菌FA08生物學(xué)特征觀察

將功能菌FA08接種至SLB培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平板,37°C培養(yǎng) 24h, 發(fā)現(xiàn)菌落白色微黃, 中間凸起, 表面光滑, 邊緣不規(guī)則, 革蘭氏染色為陽(yáng)性, 產(chǎn)芽孢。

2.3 生理生化試驗(yàn)

功能菌FA08的部分生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 功能菌FA08的生理生化檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strain FA08

2.4 16S rDNA鑒定結(jié)果

16S rDNA測(cè)序結(jié)果顯示, 菌株 FA08的 16S rDNA序列全長(zhǎng)為1407bp。全序列見(jiàn)圖2。將測(cè)得的序列輸入國(guó)際核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov), 用Blast進(jìn)行同源序列搜索, 在搜索結(jié)果中, 選出同源性較高的菌株系列(表2), 用MEGA 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析, 并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 結(jié)果如圖3所示,通過(guò)比較可以明顯看出, FA08在遺傳位置上與Bacillus licheniformis(X68416)和Bacillus licheniformis(NR118959)兩株地衣芽孢桿菌最近, 且與Bacillus licheniformis(X68416)同源性最高達(dá)99%。結(jié)合其形態(tài)學(xué)及生理、生化特征, 鑒定功能菌 FA08為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis), 登錄號(hào)為KM892857。

2.5 酶學(xué)特性分析結(jié)果

2.5.1 pH值對(duì) FA08所產(chǎn)生的纖維素酶穩(wěn)定性的影響 如圖4所示, FA08所產(chǎn)纖維素酶在pH 4下穩(wěn)定性最好, 且pH 3和pH 5—10下保持較好的穩(wěn)定性,相對(duì)酶活保持在 85%以上, 因此該酶對(duì)酸堿的耐受能力較強(qiáng)。

2.5.2 溫度對(duì)FA08所產(chǎn)生的纖維素酶穩(wěn)定性的影響如圖5所示, FA08所產(chǎn)纖維素酶在30—40°C保持較好的穩(wěn)定性, 50—70°C相對(duì)酶活保持在 75%以上,80°C下相對(duì)酶活仍能保持在 70%以上, 因此該酶對(duì)溫度具有較好的耐受能力。

2.5.3 紫外線對(duì)FA08所產(chǎn)生的纖維素酶穩(wěn)定性的影響 從圖6可以看出在紫外線照射的條件下FA08所產(chǎn)生的纖維素酶保持穩(wěn)定性, 酶活均接近 100%,因此該纖維素酶對(duì)紫外線具有很強(qiáng)的耐受性。

圖2 功能菌FA08 16S rDNA 測(cè)序結(jié)果Fig.2 The 16S rDNA sequence of strain FA08

圖3 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic dendrogram based on 16S rDNA sequence

表2 選自基因庫(kù)中用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的菌株及其錄入號(hào)Tab.2 The strains and the accession numbers in GenBank for phylogenetic dendrogram construction

圖4 pH值對(duì)FA08所產(chǎn)生的纖維素酶穩(wěn)定性的影響Fig.4 The effect of pH on the stability of cellulase produced by strain FA08

圖5 溫度對(duì)FA08所產(chǎn)生的纖維素酶穩(wěn)定性的影響Fig.5 The effect of temperature on the stability of cellulase produced by strain FA08

圖6 紫外線對(duì)FA08所產(chǎn)生的纖維素酶穩(wěn)定性的影響Fig.6 The effect of UV on the stability of cellulase produced by strain FA08

2.6 功能菌FA08發(fā)酵上清對(duì)水產(chǎn)病原菌的拮抗性能

拮抗試驗(yàn)結(jié)果表明: 如表 3所示, 功能菌 FA08對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖常見(jiàn)致病菌: 嗜水氣單胞菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌均有較強(qiáng)的抑制作用, 其中對(duì)嗜水氣單胞菌抑制作用最強(qiáng)。

表3 功能菌FA08發(fā)酵上清對(duì)病原菌的拮抗性能Tab.3 Antimicrobial activity of FA08’s supernatant on selected pathogens

3 討論

地衣芽孢桿菌作為生防細(xì)菌廣泛應(yīng)用于植物病害防治、飼料加工、醫(yī)藥開(kāi)發(fā)、環(huán)境污染治理等方面(唐娟等, 2008)。1989年, 美國(guó)FDA和美國(guó)飼料控制官員協(xié)會(huì)公布了地衣芽孢桿菌是安全的微生物物種,可以直接飼用; 我國(guó)農(nóng)業(yè)部也把地衣芽孢桿菌列入飼料添加劑目錄(馬鑫等, 2011), 允許在飼料中直接添加。另外, 地衣芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面也有很好的應(yīng)用價(jià)值, 如地衣芽孢桿菌作為魚(yú)飼料添加劑, 不僅可以促進(jìn)魚(yú)體生長(zhǎng), 而且益于養(yǎng)殖水體的保護(hù)(葛文霞等, 2014); 地衣芽孢桿菌和低聚木糖, 可提高魚(yú)體中消化酶的活性, 有助于維持腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡, 促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)(劉波等, 2006); 地衣芽孢桿菌增加了腸道消化酶活性, 促進(jìn)了魚(yú)體生長(zhǎng)(劉波等,2005)。另有研究表明, 地衣芽孢桿菌具有耐高溫、耐酸堿的特性, 并能產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶等, 有助于降解植物性飼料中某些復(fù)雜的碳水化合物, 消除抗?fàn)I養(yǎng)因子(董尚智等, 2009)。本實(shí)驗(yàn)所篩選的功能菌 FA08鑒定為地衣芽孢桿菌, 且可產(chǎn)生纖維素酶, 預(yù)示著該菌具有較好的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用前景。

通過(guò)考察地衣芽孢桿菌FA08產(chǎn)生的纖維素酶對(duì)酸堿穩(wěn)定性的影響, 發(fā)現(xiàn) FA08產(chǎn)生的纖維素酶對(duì)酸堿均能保持較好的穩(wěn)定性, pH3和pH 5—10下相對(duì)酶活保持在 85%以上, 與楊麗娜等(2012)篩選到的芽孢桿菌屬(Bacillus)微生物所產(chǎn)的纖維素酶相比, 在酸性條件下的耐受能力強(qiáng), 具有相似性, 而在中性、堿性條件下地衣芽孢桿菌FA08產(chǎn)生的纖維素酶更具耐受能力。水產(chǎn)動(dòng)物大多數(shù)無(wú)胃, 消化道呈中性(鯉科魚(yú)類)或偏堿性(王仁華等, 2011), 因此地衣芽孢桿菌FA08產(chǎn)生的纖維素酶不僅適合于有胃的動(dòng)物, 而且也適合應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物。另外, 地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)條件要求低, 繁殖快, 能迅速定植在腸黏膜上, 在短時(shí)間內(nèi)成為腸道的優(yōu)勢(shì)菌群(張菊等, 2012), 并在腸道中發(fā)揮作用, 有利于開(kāi)發(fā)成為內(nèi)服的微生物制劑。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 地衣芽孢桿菌FA08產(chǎn)生的纖維素酶對(duì)溫度有較好的耐受能力, 耐受 80°C下相對(duì)酶活仍能保持在 70%以上, 與葛春輝(2009)篩選到的蠟質(zhì)芽孢桿菌所產(chǎn)的纖維素酶相比, 更具有耐溫特性。在飼料原料中, 雜粕類的原料粗纖維含量高, 存在抗?fàn)I養(yǎng)因子, 大大限制了其在飼料中的使用量, 目前發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用, 可提高雜粕類原料的使用價(jià)值, 降解雜粕原料中水產(chǎn)動(dòng)物難以消化的纖維素, 消除抗?fàn)I養(yǎng)因子, 提高雜粕原料的利用率。一般飼料原料的發(fā)酵溫度可達(dá)60—80°C, 而地衣芽孢桿菌FA08產(chǎn)生的纖維素酶可較好耐受發(fā)酵溫度, 可應(yīng)用于雜粕的發(fā)酵, 提高雜粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

地衣芽孢桿菌對(duì)有害微生物具有拮抗作用: 如地衣芽孢桿菌 Wl0能產(chǎn)生抗菌蛋白, 對(duì)多種植物病原菌有較好的抑制效果(紀(jì)兆林等, 2013); 又如地衣芽孢桿菌 c-4具有較廣的抑菌范圍, 對(duì)番茄枯萎病菌、玉米彎孢葉斑病菌、膠孢炭疽病菌、棉花枯萎病菌、棉花黃萎病菌、小麥赤霉病菌和西瓜枯萎病菌等均有抑制作用(孫正祥等, 2009)。然而地衣芽孢桿菌對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌的拮抗特性報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)也探討了地衣芽孢桿菌FA08發(fā)酵上清對(duì)水產(chǎn)常見(jiàn)病原菌的拮抗效果, 發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌FA08對(duì)水產(chǎn)病原菌:嗜水氣單胞菌、愛(ài)德華氏菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌均有較強(qiáng)的拮抗作用。由于地衣芽孢桿菌具有在水產(chǎn)動(dòng)物腸道定植的特性,這意味著地衣芽孢桿菌 FA08進(jìn)入水產(chǎn)動(dòng)物腸道后,在腸道內(nèi)可產(chǎn)生拮抗物質(zhì), 對(duì)病原菌進(jìn)行抑制或殺滅作用, 促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物腸道健康, 有著重要的意義,另外, 也可利用 FA08的拮抗性能, 制備微生物殺菌劑。

本研究開(kāi)展了地衣芽孢桿菌FA08的篩選與鑒定,考察了該菌的酶學(xué)性質(zhì)和抗菌特性, 初步評(píng)估該菌的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用價(jià)值, 下一步將進(jìn)行其作為養(yǎng)殖動(dòng)物腸道定植菌、雜粕飼料發(fā)酵菌及制備微生物殺菌劑的研究與開(kāi)發(fā), 實(shí)現(xiàn)FA08在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用價(jià)值。

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