茶樹銨態(tài)氮的轉(zhuǎn)運(yùn)與同化研究進(jìn)展

李 維，向 芬，李賽君，劉紅艷，包小村

（湖南省茶葉研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

氮素是世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中消耗量最大的元素之一[1]，氮的消耗量日益增加，但利用效率逐漸下降。從國內(nèi)外的示蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，茶樹的氮肥利用率只有 10%～50%[2]。大量氮素因揮發(fā)、流失浪費(fèi)，引起一系列的環(huán)境污染問題[3]。隨著人口數(shù)量的激增，能源危機(jī)、環(huán)境污染等問題成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，如何提高作物氮素效率成為當(dāng)前植物營養(yǎng)學(xué)的研究熱點(diǎn)。

土壤中存在多種形態(tài)的氮源，長(zhǎng)期的生物進(jìn)化和環(huán)境適應(yīng)導(dǎo)致植物根系對(duì)不同形態(tài)氮的吸收部位、機(jī)理及調(diào)控有較大差別。因此，植物長(zhǎng)期生長(zhǎng)在以某一形態(tài)氮源為主的土壤上就形成了不同的氮吸收機(jī)制，從而導(dǎo)致不同種類植物根系對(duì)土壤中不同氮源的吸收具有明顯的選擇性。在以或?yàn)橹饕吹耐寥乐?，植物表現(xiàn)出明顯的喜或喜特性，而在氮礦化和硝化受到抑制的地區(qū)（如高緯度地區(qū)），植物也可以直接吸收利用土壤中的有機(jī)氮[4]。以茶樹為例，不同地域的茶樹長(zhǎng)期以來受到其生態(tài)環(huán)境、地域土壤以及人為馴化等方面的影響，各茶樹品種對(duì)不同形態(tài)氮的喜好程度，以及同形態(tài)氮素的利用效率之間均存在著顯著差異[5-7]。

植物氮利用率主要取決于銨轉(zhuǎn)運(yùn)、同化效率的高低，因此，研究茶樹氮素利用效率應(yīng)從其氮轉(zhuǎn)運(yùn)入手，開展茶樹的氮轉(zhuǎn)運(yùn)、同化機(jī)理研究，從作物生理學(xué)與植物分子生物學(xué)方面解析茶樹對(duì)的轉(zhuǎn)運(yùn)與同化機(jī)制，提高茶樹對(duì)氮肥的利用效率，對(duì)實(shí)現(xiàn)茶葉高產(chǎn)高效、減輕環(huán)境污染和促進(jìn)茶產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。文中對(duì)茶樹以及其他植物的轉(zhuǎn)運(yùn)、同化方面的研究以及先進(jìn)生物技術(shù)手段在茶樹上的應(yīng)用進(jìn)行了綜述并提出了展望，為提高茶樹氮素利用提供有效的理論參考。

茶樹作為一種喜銨性作物[2]，與其他植物有所不同，它是以葉片為收獲目標(biāo)，不僅要?dú)v經(jīng)春茶、夏茶、秋茶3 次茶葉采摘，還需要進(jìn)行采茶期末的樹冠修剪，帶走大量氮素，茶樹本身不能固氮，因此，茶樹對(duì)外界氮素的需求量極大。茶樹體內(nèi)游離氨基酸以茶氨酸為主，并將其作為一種中間氮源在根部合成并貯存，當(dāng)?shù)厣喜糠稚L(zhǎng)需要氮素營養(yǎng)時(shí)，氮素可以茶氨酸和酰胺的形式通過木質(zhì)部向上運(yùn)輸。因此，茶樹在的轉(zhuǎn)運(yùn)方面也必然與其他植物存在差異。王新超[1]、阮建云[8]等的研究表明，茶樹氮素的利用效率與吸收速率均存在品種間和氮素水平間的顯著差異，而其根系對(duì)氮的吸收效率是決定不同品種茶樹氮素利用效率差異的主要因素。其研究還表明，茶樹對(duì)銨態(tài)氮的吸收與同化速率呈極顯著正相關(guān)。向芬[6]等對(duì)游離氨基酸總量不同的保靖黃金茶1 號(hào)、福鼎大白茶、白毫早3個(gè)品種在不同梯度銨處理下根系活力的表現(xiàn)情況進(jìn)行了研究，結(jié)果亦表明，茶樹品種間、相同品種不同銨濃度處理間茶樹根系活力均存在顯著差異，且與其游離氨基酸總量呈正相關(guān)，這進(jìn)一步證明了銨態(tài)氮的同化速率與轉(zhuǎn)運(yùn)速率密切相關(guān)。

茶樹GS 酶活研究方面，王新超等[1]比較了不同基因型茶樹的GS 酶活性，杜旭華等[25]結(jié)合農(nóng)作物上提取GS 并測(cè)定的方法，針對(duì)茶樹進(jìn)行了不同pH 緩沖液等提取方法對(duì)GS 酶活的影響研究，并得出不同基因型茶樹的GS 酶活差異顯著。由此可知，不同基因型茶樹GS 合成酶基因（CsGS）必然有其特異性。目前茶樹中部分CsGS 編碼基因[26-29]已被克隆。Rana N K 等[30]對(duì)茶樹不同部位的組織、器官中GS 酶活與CsGS 表達(dá)特征進(jìn)行了研究，結(jié)果表明CsGS 在芽頭中表達(dá)量最高，且隨著葉位和葉齡的增加其表達(dá)量逐漸下降，GS 酶活也表現(xiàn)出同樣的趨勢(shì)。此外，Rana N K 等[31]的研究還表明芽頭和嫩葉中CsGS 表達(dá)受氮素形態(tài)的影響。暗處理時(shí)，CsGS 表達(dá)只受到銨態(tài)氮的影響，硝態(tài)氮對(duì)其無影響，且銨態(tài)氮能增加GS 酶活，但硝態(tài)氮對(duì)GS 酶活有抑制作用；光處理下，兩種氮源對(duì)茶樹GS 酶活性均有促進(jìn)作用。這表明外源銨對(duì)茶樹CsGS 表達(dá)調(diào)控作用的重要性。史成穎等[32]研究了鹽酸乙胺誘導(dǎo)處理茶樹愈傷組織后3～12 d，GS1;1等茶氨酸合成酶相關(guān)基因表達(dá)量明顯增加，表明其在含氮化合物特別是乙胺的同化中有積極作用，這也間接表明作為乙胺前體物質(zhì)之一——外源NH4+的含量會(huì)對(duì)GS1;1 等基因表達(dá)產(chǎn)生一定影響[33]。這表明茶樹銨轉(zhuǎn)運(yùn)效率的差異必然會(huì)影響到CsGS 等銨同化基因的表達(dá)。周小生等[34]對(duì)5個(gè)品種茶樹的GS、GOGAT 和 GDH 活性進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)其關(guān)聯(lián)基因CsGS 和CsGDH2 表達(dá)量進(jìn)行了研究，其結(jié)果表明不同施氮水平能顯著影響茶樹葉片中同化關(guān)鍵酶活性以及相關(guān)基因表達(dá)水平，從更深層次闡述了不同基因型茶樹氮素吸收及利用效率的差異特點(diǎn)。

3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)為茶樹銨轉(zhuǎn)運(yùn)、同化研究提供新的方法

基于高通量測(cè)序平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNAseq），具有通量高、覆蓋范圍廣、精度高等特點(diǎn)，能夠在單核苷酸水平對(duì)任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)，也可以用于分析真核生物復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)及表達(dá)水平，提供最全面的轉(zhuǎn)錄組信息[35]。另外，RNA-Seq 的靈敏度高，在分析轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平的同時(shí)，還能發(fā)現(xiàn)未知和稀有轉(zhuǎn)錄本。轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究從擬南芥、水稻等模式植物到紫花苜蓿、番茄等非模式植物鑒定了大量的逆境脅迫、元素處理等等的應(yīng)答基因，并對(duì)作物相應(yīng)的作用機(jī)理進(jìn)行了探討，加深了人們對(duì)作物體內(nèi)分子響應(yīng)機(jī)制的認(rèn)識(shí)[36]。因此，通過RNA-seq，不僅可以提供大量候選功能基因，也是一個(gè)經(jīng)濟(jì)快速地得到大量作物轉(zhuǎn)錄組信息的新方法，而能否發(fā)現(xiàn)新的功能基因成為衡量以測(cè)序技術(shù)為代表的轉(zhuǎn)錄組學(xué)的關(guān)鍵價(jià)值所在。

茶樹轉(zhuǎn)錄組學(xué)方面，史成穎等[32]通過基于新一代Ilumina 測(cè)序平臺(tái)的深度轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，得到了127 094個(gè)茶樹的unigene，通過與Uniprot、NCBI 的NR、COG 數(shù)據(jù)庫、Pfam、KEGG 等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì)，注釋了55 088個(gè)unigene 的功能，并從中選擇了11個(gè)可能與茶氨酸代謝相關(guān)的基因進(jìn)行qRT-PCR來定量分析它們?cè)诓璋彼岷坎町惷黠@的茶愈傷組織中表達(dá)量的差異。王麗鴛等[37]通過應(yīng)用新一代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)茶樹花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過基因表達(dá)水平RPKM 值分布分析，發(fā)現(xiàn)茶樹花的轉(zhuǎn)錄組以中低表達(dá)豐度的基因?yàn)橹鳌＝?jīng)過和蛋白數(shù)據(jù)庫NR、Sw issprot、KEGG 和COG 4個(gè)數(shù)據(jù)庫比對(duì)，共有50 975 條茶樹花轉(zhuǎn)錄組的unigene 被注釋。這些均表明轉(zhuǎn)錄組學(xué)越來越受到茶葉科技人員的重視。關(guān)于茶樹銨轉(zhuǎn)運(yùn)、同化吸收的研究較少，其機(jī)理還不太清楚，與其他作物相比，眾多銨轉(zhuǎn)運(yùn)、同化關(guān)鍵基因亟待發(fā)掘。通過RNA-seq 獲取大量茶樹轉(zhuǎn)錄組信息，可以為深入研究茶樹的轉(zhuǎn)運(yùn)、同化機(jī)理提供新的技術(shù)手段。

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