膽囊Cajal間質(zhì)細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)與鑒定

譚宇彥，王晶敏，王棟，嵇振嶺

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 普外科，江蘇 南京 210000)

·論 著·

膽囊Cajal間質(zhì)細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)與鑒定

譚宇彥，王晶敏，王棟，嵇振嶺

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 普外科，江蘇 南京 210000)

目的:探討兔膽囊Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)的原代分離、培養(yǎng)及鑒定的方法。方法:選擇出生后4～5周齡的新西蘭大白兔，經(jīng)耳緣靜脈注入空氣處死，在無菌條件下取出膽囊，在解剖顯微鏡下剝?nèi)ツ懩茵つず宛つは聦?，利用Ⅱ型膠原酶消化法分離膽囊原代ICC，接種于含有干細(xì)胞因子的M199培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。倒置顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)情況，用酪氨酸蛋白激酶受體c-kit特異性抗體免疫熒光染色進(jìn)行鑒定。結(jié)果：細(xì)胞穩(wěn)定貼壁后，在倒置顯微鏡下觀察可見ICC呈梭形、三角形，有突起；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，突起細(xì)長(zhǎng)化并彼此相互連接形成網(wǎng)絡(luò)。該類細(xì)胞c-kit抗體免疫熒光染色呈陽(yáng)性。結(jié)論：成功建立了一套膽囊原代ICC培養(yǎng)的方法，為研究ICC的生物學(xué)特性及其與膽囊動(dòng)力障礙性疾病的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

Cajal間質(zhì)細(xì)胞；膽囊；原代細(xì)胞培養(yǎng)

Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal，ICC)是消化道慢波電位的起搏細(xì)胞和信號(hào)傳導(dǎo)細(xì)胞， 主要參與基本電節(jié)律的產(chǎn)生和調(diào)控，對(duì)維持消化道正常運(yùn)動(dòng)功能起著決定性作用[1]。ICC的異常與多種消化道動(dòng)力紊亂性疾病密切相關(guān)。膽囊收縮功能障礙是膽囊結(jié)石的主要病因，ICC對(duì)膽囊運(yùn)動(dòng)起著重要的調(diào)節(jié)作用[2]。分離、培養(yǎng)膽囊原代ICC，是研究ICC功能以及膽囊運(yùn)動(dòng)障礙在膽石形成過程中相關(guān)機(jī)制的基礎(chǔ)。目前，對(duì)于膽囊ICC原代培養(yǎng)的報(bào)道甚少。我們研究應(yīng)用酶解法并結(jié)合梯度離心技術(shù)，對(duì)膽囊原代ICC的培養(yǎng)、分離及鑒定進(jìn)行初步的探討。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

出生后4～5周齡的新西蘭大白兔，購(gòu)自江蘇省農(nóng)科院模式動(dòng)物研究所，雌雄不限。

M119培養(yǎng)基(美國(guó)，HyClone公司)，Ⅱ 型膠原酶(美國(guó)，Sigma)，胎牛血清(美國(guó)，HyClone公司)，重組干細(xì)胞因子(美國(guó)，Sigma公司)，F(xiàn)icoll400分離液(美國(guó)，Pharmacia公司)，兔抗c-kit多克隆抗體(美國(guó)，Santa Cruz公司)，山羊抗兔FITC標(biāo)記熒光二抗(美國(guó)，Santa Cruz公司)，細(xì)胞核抗體DAPI(丹麥，DAKO公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1膽囊組織單細(xì)胞懸液的制備 新西蘭大白兔經(jīng)耳緣靜脈注入空氣處死，在無菌條件下迅速切除膽囊，縱行切開將膽汁排凈，用含1%青鏈雙抗的D-Hank′s液沖洗干凈。在解剖顯微鏡下銳性剝離膽囊黏膜及黏膜下層，再用含1%青鏈雙抗D-Hank′s液反復(fù)沖洗2～3次，將膽囊剪碎為1 mm×1 mm小塊，放置離心管，加入8 ml Ⅱ 型膠原酶(1.3 mg·ml-1)，37 ℃消化15 min后以1 500 r·min-1離心3 min，去上清液，加入無血清M199培養(yǎng)基5 ml反復(fù)吹打3 min，1 500 r·min-1離心5 min，去上清液。用10 ml無血清M199培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，過200目篩網(wǎng)去除大塊組織，將細(xì)胞加在等體積20%Fillcoll 400梯度密度液上，1 500 r·min-1離心5 min，取液面交界細(xì)胞沉淀。

1.2.2接種細(xì)胞 用M199培養(yǎng)基(含20%FBS，1%青鏈雙抗，SCF 5 ng·ml-1)，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106ml-1，接種至6孔板，板中預(yù)先放置數(shù)鼠尾膠原(2 ng·ml-1)包被的蓋玻片。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃，O2濃度95%，CO2濃度5%)。細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)8 h后換液，沖去未貼壁的細(xì)胞，更換M199培養(yǎng)基(成分同上)繼續(xù)培養(yǎng)。以后每2天換液1次，注意觀察培養(yǎng)基有無渾濁、顏色變淡、漂浮物和絮狀物等。

1.2.3免疫熒光鑒定 穩(wěn)定培養(yǎng)1周后，進(jìn)行免疫熒光鑒定。傾倒培養(yǎng)基，用PBS漂洗5 min×3次，4%多聚甲醛室溫下固定20 min，PBS漂洗5 min×3次，用5%山羊血清室溫下封閉30 min，加入兔抗c-kit多克隆抗體(1∶100)4 ℃冰箱過夜。次日取出后用PBS漂洗 5 min×3次，加入DAPI染核5 min，PBS漂洗5 min×3次，封片劑封片，共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 倒置顯微鏡下ICC形態(tài)變化

膽囊原代ICC接種8 h后，在倒置顯微鏡下見ICC貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞邊界清晰，包體成梭形、紡錘形或三角形，細(xì)胞核大，細(xì)胞質(zhì)較少，折光性強(qiáng)，并可見從包體發(fā)出的細(xì)長(zhǎng)突起樣結(jié)構(gòu)(圖1)，但I(xiàn)CC特有的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)不明顯，并可偶見少量條帶狀平滑肌細(xì)胞。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至72 h后，可見ICC通過側(cè)突相互接觸成網(wǎng)狀(圖2)。

2.2 熒光顯微鏡下ICC形態(tài)學(xué)變化

酪氨酸蛋白激酶受體c-kit是ICC特異性標(biāo)記，通過c-kit抗體免疫染色可以對(duì)其進(jìn)行鑒定。選擇培養(yǎng)至7 d的細(xì)胞進(jìn)行c-kit熒光染色，在共聚焦顯微鏡下觀察，可見胞體呈綠色熒光c-kit染色陽(yáng)性的長(zhǎng)梭形細(xì)胞即ICC。DAPI復(fù)染細(xì)胞核后可見細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光染色(圖3)。

圖1 ICC體外培養(yǎng)8 h光鏡下細(xì)胞形態(tài)

圖2 ICC體外培養(yǎng)72 h光鏡下細(xì)胞形態(tài)

圖3 ICC免疫熒光鑒定(c-kit陽(yáng)性)

3 討 論

ICC是西班牙神經(jīng)解剖學(xué)家Cajal于1893年在胃腸道奧爾巴赫神經(jīng)叢(Auerbach′s plexus)、深肌層、環(huán)行肌層內(nèi)觀察到的一類特殊的間質(zhì)細(xì)胞[3]，它特異性地表達(dá)酪氨酸蛋白激酶受體c-kit，通過c-kit抗體可以對(duì)其進(jìn)行鑒定[4]。目前認(rèn)為，ICC主要的功能是產(chǎn)生和傳導(dǎo)慢波電位，介導(dǎo)神經(jīng)信號(hào)傳遞，調(diào)控消化道運(yùn)動(dòng)[5]。研究表明，多種消化道動(dòng)力障礙性疾病與ICC異常密切相關(guān)[6-9]。膽囊結(jié)石是消化系統(tǒng)一種常見疾病[10]，ICC數(shù)量減少導(dǎo)致的膽囊收縮功能障礙是膽囊結(jié)石的主要病因之一[11]。所以，如果能在體外對(duì)膽囊原代ICC進(jìn)行分離、培養(yǎng)和鑒定，對(duì)進(jìn)一步研究ICC的功能、特性以及探討其對(duì)膽囊運(yùn)動(dòng)功能的影響在膽囊結(jié)石形成過程中的作用機(jī)制有著重要的意義。

長(zhǎng)期以來ICC的體外培養(yǎng)一直是個(gè)難點(diǎn)，我們?cè)诳偨Y(jié)先前學(xué)者們的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)行反復(fù)的實(shí)驗(yàn)，總結(jié)了一些關(guān)于膽囊原代ICC培養(yǎng)的經(jīng)驗(yàn)。ICC培養(yǎng)有以下幾個(gè)問題值得注意:(1) 避免污染。消化道內(nèi)含有大量的細(xì)菌，稍有不慎即可發(fā)生污染。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，一旦發(fā)生污染，細(xì)胞折光性降低，伸展、貼壁能力喪失，繼而發(fā)生死亡，所以避免污染是ICC成功培養(yǎng)的前提。在實(shí)驗(yàn)過程中，我們?cè)贒-Hank′s液和細(xì)胞培養(yǎng)基中均加入青鏈雙抗，以減少污染的發(fā)生。(2) 縮短膽囊體外存留時(shí)間。合理的實(shí)驗(yàn)安排和熟練的操作以縮短組織在體外存留時(shí)間是保證細(xì)胞存活數(shù)量的重要因素。因此，我們?cè)谔幩绖?dòng)物摘取膽囊后，立即對(duì)組織進(jìn)行處理，盡量縮短體外存留時(shí)間。(3) 剝離膽囊黏膜及黏膜下層。肥大細(xì)胞是消化道除ICC外唯一表達(dá)c-kit的細(xì)胞，主要位于黏膜層和黏膜下層，而ICC是位于膽囊肌層內(nèi)[12]。仔細(xì)剝離黏膜和黏膜下層能去除肥大細(xì)胞并減少其對(duì)ICC鑒定的干擾。(4) 嚴(yán)格控制Ⅱ型膠原酶消化時(shí)間。Ⅱ型膠原酶消化時(shí)間過久對(duì)細(xì)胞影響較大，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，提取腸道ICC時(shí)酶消化腸道組織時(shí)間一般為30 min[13]。我們通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在37 ℃下酶消化膽囊組織時(shí)間控制在15 min左右為宜，細(xì)胞的成活率相對(duì)較高。(5) 梯度離心和早期換液。分離原代ICC的同時(shí)也夾雜著部分平滑肌細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞沉降系數(shù)和貼壁時(shí)間不同的特點(diǎn)，我們利用Ficoll400進(jìn)行梯度離心，并取液面交界的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；因ICC貼壁時(shí)間較平滑肌細(xì)胞早，接種8 h候后即換液，可以去除貼壁較晚的平滑肌細(xì)胞和活力較差的ICC，為貼壁的ICC生長(zhǎng)創(chuàng)造良好的環(huán)境，同時(shí)也提高了ICC的純度。(6) 干細(xì)胞因子(Stem cell factor， SCF)的作用。SCF是c-kit的天然配體，對(duì)ICC正常生長(zhǎng)、表型維持、細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定起著重要作用[14]。本實(shí)驗(yàn)中，在培養(yǎng)基中加入了5 ng·ml-1的SCF對(duì)原代ICC成功培養(yǎng)至關(guān)重要。

本實(shí)驗(yàn)成功地對(duì)膽囊原代ICC進(jìn)行分離、培養(yǎng)和鑒定，為今后進(jìn)一步研究ICC的生理特性以及其在膽囊結(jié)石發(fā)病中的作用機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)。然而，該種方法培養(yǎng)的ICC沒有達(dá)到較高的純度，目前有學(xué)者通過流式細(xì)胞儀和免疫磁珠法來純化腸道ICC。我們將繼續(xù)研究，以摸索出一套高效、高純的膽囊原代ICC培養(yǎng)方法。

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Isolation， culture and identification of interstitial cells of Cajal from gallbladderinvitro

TAN YU-yan，WANG Jing-min，WANG Dong，JI Zhen-ling

(DepartmentofGeneralSurgery，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210000，China)

Objective: To investigate the method of isolation， culture and identification of interstitial cells of Cajal (ICC) from the rabbit gallbladderinvitro. Methods: ICC were derived from gallbladder tissue of New Zealand white rabbit by enzymatic dissociation of collagenase type Ⅱ and cultured in M199 medium. The morphological characteristics of ICC was observed with an inverted microscope， and the cell phenotype was identified by immunofluorescence staining using specific antibody against receptor tyrosine kinase c-kit with the confocal microscopy. Results: ICC exhibited a few triangle or spindle shaped axis-cylinders after cells attachment， and the long processes were observed to build synapse and form the net-work structure of cells after 3 days. Cultured ICC were positive for immunofluorescence staining of c-kit antibody. Conclusion: The enzymolysis method for primary culture of ICC from rabbit gallbladder is feasible， which may provide a basis for research into the biological function of ICC and the relationship between the ICC and gallbladder motility disorders.

interstitial cells of Cajal; gallbladder; primary cell culture

2014-12-18

2015-01-28

江蘇省科技計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(7790000049)

譚宇彥(1978-)，男，湖南湘潭人，在讀博士研究生，副主任醫(yī)師。E-mail:tyytyz@sina.com

嵇振嶺 E-mail:zlji@vip.sina.com

譚宇彥，王晶敏，王棟，等.膽囊Cajal間質(zhì)細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)與鑒定[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2015，34(3)：390-393.

R657.42

A

1671-6264(2015)03-0390-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.03.014