PD-1/PD-L1負(fù)性協(xié)同刺激通路在乙型病毒性肝炎慢性化中的地位及進展

徐成潤 綜述，伍偉平 審校

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是不直接引起細(xì)胞破壞的嗜肝DNA病毒，HBV持續(xù)感染造成乙型肝炎的慢性化，其臨床轉(zhuǎn)歸是由病毒和宿主兩方面的因素決定，其中機體免疫功能異常是造成HBV慢性持續(xù)感染的原因之一。在急性自限性乙型肝炎患者體內(nèi)存在多克隆、特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)和I型輔助性T(Th1)細(xì)胞反應(yīng)［1］，而慢性HBV感染者體內(nèi)病毒特異性CTL和Th細(xì)胞存在數(shù)量和功能上的缺陷。導(dǎo)致機體在防御病毒感染與維持自身耐受之間失去平衡的疾病慢性化、免疫耐受、腫瘤發(fā)生的確切機制尚有許多不明之處，但病毒抗原的持續(xù)存在導(dǎo)致體內(nèi)特異性效應(yīng)T細(xì)胞功能缺損是一個重要原因，而T細(xì)胞的狀態(tài)與細(xì)胞程序性死亡因子－1/細(xì)胞程序性死亡因子配體(PD-1/PD-L1)刺激信號密切相關(guān)［2］。

1 PD-1及其配體PD-L1

1.1 結(jié)構(gòu)和表達 PD-1(programmed cell death 1)，也稱CD279，屬于B7免疫球蛋白超家族成員，相對分子量為55 000，結(jié)構(gòu)上與CTLA-4有23%的同一性，胞外區(qū)由一個IgV樣域組成，胞質(zhì)區(qū)含有兩個酪氨酸信號基序，其一為免疫受體酪氨酸抑制模體(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif，ITIM)，另一為免疫受體酪氨酸交換模體(immunoreceptor tyrosine-based switch motif，ITSM)。ITSM 募集磷酸酶SHP-1和SHP-2，使TCR或BCR傳遞的效應(yīng)信號發(fā)生去磷酸化，同時PD-1信號降低CD28介導(dǎo)的信號，抑制Akt激酶磷酸化、糖代謝及Bcl-XL的表達。PD-1表達較為廣泛，可在活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和骨髓細(xì)胞上表達;少量表達于NK-T細(xì)胞表面［3］。因此和CTLA-4相比，其表達范圍更廣，預(yù)示著其作用也更為廣泛。

PD-1已被證明有兩個配體，分別為PD-L1(又稱B7-H1)和PD-L2(又稱B7-DC)。1999年發(fā)現(xiàn)并證實的PD-L1屬B7超家族成員，人PD-L1基因定位于人9p24.2，可編碼290個氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白，其胞外段為IgV和IgC樣結(jié)構(gòu)域。PD-L1的mRNA 主要為4.2 kb，此外還有 1.8 kb、3.7 kb 和7.2 kb這3種轉(zhuǎn)錄形式，但其編碼產(chǎn)物相同，且功能相似。PD-L1基因與B7-1、B7-2基因的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)十分相似，因而表現(xiàn)出相似的生物學(xué)功能。PD-L1表達于DC、B細(xì)胞、T細(xì)胞及髓系細(xì)胞，當(dāng)這些細(xì)胞激活時 PD-L1表達上調(diào)［4］。此外，與 B7-1、B7-2不同，PD-L1也表達于非造血細(xì)胞如血管內(nèi)皮細(xì)胞，因此在非淋巴器官中也有表達，可表達于心臟、肺、胰腺、肝臟、肌肉和免疫豁免部位，如眼和胎盤［5-6］。由于PD-L1能在非淋巴組織中表達，因而推測PD-1/PD-L1信號途徑不僅在淋巴器官，而且在非淋巴器官都能調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，預(yù)示PD-1/PD-L1信號可能在這些外周器官中通過調(diào)節(jié)自身反應(yīng)性T細(xì)胞、B細(xì)胞來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。PD-L2和PD-L1有40%的序列相同。與PD-L1不同，PD-L2僅表達于已誘導(dǎo)激活的巨噬細(xì)胞和DC，初步研究顯示PD-L2與PD-1的親和力大于PD-L1的3～6倍，并有不同的結(jié)合、解離動力學(xué)［7］。因此，PD-L1可能是外周組織、器官中主要的調(diào)節(jié)配體，而PD-L2則是在淋巴器官的免疫調(diào)節(jié)中起主導(dǎo)作用。

1.2 生物學(xué)特性 組織上表達的PD-L1對保護外周組織不受自身免疫的攻擊至關(guān)重要。實質(zhì)細(xì)胞表達PD-L1，通過PD-1/PD-L1通路維持耐受狀態(tài)，如阻斷該通路，則可使自身免疫性疾病加重或腫瘤發(fā)生［2，8］。研究表明，PD-1/PD-L1 信號途徑能有效抑制T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，且其結(jié)合力遠(yuǎn)大于PD-1與CD28的結(jié)合力［9］。對自身免疫性糖尿病NOD小鼠模型，PD-1-/-NOD小鼠［10］和PD-L1-/-NOD小鼠［11］都表現(xiàn)為糖尿病快速進展。無論是胰腺β細(xì)胞還是血管內(nèi)皮上表達的PD-L1對于NOD小鼠自身免疫性糖尿病的發(fā)生都有保護作用。還有研究表明，用抗PD-L1 mAb阻斷PD-1/PD-L1通路可以抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)的功能［12］。將異源C57BL/6脾細(xì)胞過繼輸入NOD/SCID小鼠發(fā)生移植物抗宿主病(GvHD)是致命的，而Treg細(xì)胞對于GvHD的抑制作用在給予抗PD-L1 mAb后終止，說明阻斷PD-1/PD-L1通路可以終止Treg介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)功能。亦有報道在慢性炎癥中，PD-L1可通過 STAT-5的磷酸化負(fù)性調(diào)控Treg［13］。

在抗微生物感染免疫中，PD-1/PD-L1通路也起到關(guān)鍵作用?？赡芙^大部分微生物通過利用PD-1/PD-L1通路降低被清除的免疫，引起慢性、持續(xù)性感染［2］。在慢性病毒感染時，病毒特異性CD8+T細(xì)胞的功能通常都會減弱［14］，這與急性感染或疫苗接種后產(chǎn)生強力的效應(yīng)和記憶性CD8+T細(xì)胞不同。在慢性感染模型中，如靈長類SIV感染、小鼠LCMV感染或HBV、HCV、HIV等病毒感染，通?？梢杂^察到去功能化的病毒特異性CD8+T細(xì)胞持續(xù)存在，其代表一系列免疫缺陷［15］。隨病毒載量的升高，病毒特異性T細(xì)胞的功能受損更加嚴(yán)重，早期的去功能化主要表現(xiàn)在增殖和產(chǎn)生IL-2的能力的喪失，晚期則表現(xiàn)為產(chǎn)生效應(yīng)性細(xì)胞因子和溶細(xì)胞的功能的喪失。研究表明慢性HIV感染、LCMV感染及HCV感染時外周血CD8+T細(xì)胞上PD-1高度表達［16-18］，病毒感染基礎(chǔ)上的腫瘤亦可促進Jurkat細(xì)胞的PD-1高表達［19］。慢性感染時PD-1上調(diào)，PD-1/PD-L1通路在這一感染過程中對調(diào)節(jié)T細(xì)胞缺損有重要作用。使用抗PD-1或抗PD-L1阻斷抗體，病毒特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)明顯增強，表現(xiàn)為特異性CD8+T細(xì)胞數(shù)量顯著增加，分泌的細(xì)胞因子增多及細(xì)胞毒功能增強［19］，功能恢復(fù)的病毒特異性CD8+T細(xì)胞使病毒載量明顯下降，但不會促進特異性CD8+T細(xì)胞的溶解活性［19］。有研究表明阻斷PD-1/PD-L1通路可使T細(xì)胞增生、CD8+T細(xì)胞的功能改善，抗PD-L1還可以恢復(fù)CD4+T細(xì)胞對HIV抗原的增生應(yīng)答［20-21］，抗PD-L1可促進HCV特異性CD8+T細(xì)胞的增生。這些研究表明PD-1/PD-L1通路可以在慢性HIV和HCV感染中阻止抗病毒T細(xì)胞應(yīng)答，阻斷這一通路可能恢復(fù)失能的T細(xì)胞，成為抗病毒治療的新策略。

2 肝臟免疫

肝臟是重要的免疫調(diào)節(jié)器官，而肝臟調(diào)節(jié)免疫的結(jié)果往往導(dǎo)致免疫耐受，目前認(rèn)為肝臟庫弗細(xì)胞、DC、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)等非實質(zhì)細(xì)胞是肝臟發(fā)揮免疫功能的細(xì)胞基礎(chǔ)。Iwai等［22］研究證實PD-L1是LSEC誘導(dǎo)免疫耐受的分子基礎(chǔ)之一，PD-L1在小鼠庫弗細(xì)胞、LSEC均可表達。構(gòu)建活化PD-1小鼠T淋巴細(xì)胞與肝臟非實質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)，結(jié)果其T淋巴細(xì)胞增殖活性較WT小鼠明顯增強，向WT小鼠T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中加抗PD-L1，T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)也增強。靜脈注射重組表達lac-Z的腺病毒引起的肝炎中PD-1小鼠T淋巴細(xì)胞增殖明顯，而脾臟中T淋巴細(xì)胞增殖活性與WT小鼠T淋巴細(xì)胞無差異，肝臟病理上PD-1小鼠表現(xiàn)為嚴(yán)重但短暫的肝炎，同時伴大量肝細(xì)胞凋亡，WT小鼠肝臟病理改變較輕，但清除病毒的時間卻明顯延長。肝臟是活化T淋巴細(xì)胞特異性聚集部位，并在此誘導(dǎo)凋亡，因此T淋巴細(xì)胞的肝內(nèi)清除也是肝臟誘導(dǎo)免疫耐受的原因之一，而PD-L1是決定T淋巴細(xì)胞在肝內(nèi)聚集和清除的效應(yīng)分子。Dong等［23］發(fā)現(xiàn) PD-L1缺陷小鼠(KO)的 T淋巴細(xì)胞在淋巴器官發(fā)育正常，在肝內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量則明顯增多，其中CD4+T淋巴細(xì)胞輕度增加，CD8+T淋巴細(xì)胞增多顯著。在刀豆蛋白A誘發(fā)的自身免疫性肝炎中，PD-L1缺陷的小鼠肝炎癥狀較WT小鼠明顯為重，且死亡率高，同時自然殺傷T淋巴細(xì)胞減少，肝內(nèi)CD8+T淋巴細(xì)胞明顯增加，激活誘導(dǎo)的CD8+T淋巴細(xì)胞凋亡明顯減少。由此可以看出PD-L1參與了肝臟的免疫調(diào)節(jié)功能，是肝臟維持T淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，以及誘導(dǎo)耐受、抗病毒反應(yīng)的分子基礎(chǔ)之一。

3 PD-1/PD-L1通路與慢性乙型肝炎

抗病毒治療是慢性乙型肝炎治療的一個重要手段，有效的T細(xì)胞免疫應(yīng)答是清除病毒的關(guān)鍵，HBV慢性感染過程中，機體效應(yīng)、記憶性T細(xì)胞的功能缺損及病毒免疫逃避機制導(dǎo)致感染的持續(xù)性［24］，其抗病毒療效明顯低于急性感染者。T細(xì)胞的有效激活需要雙信號，其中由APC表面分子與T細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合所提供的第二刺激信號是非抗原特異性的，且是T細(xì)胞抗原特異性激活所必需的，決定受抗原刺激的T細(xì)胞是活化為效應(yīng)細(xì)胞，還是去功能化或凋亡。其正向刺激信號分子以CD28為代表，負(fù)向協(xié)同共刺激分子PD-1/PD-L1通路最新認(rèn)為與慢性病毒感染關(guān)系最為密切。研究表明，慢性HBV感染時，外周血T細(xì)胞中的PD-1表達水平明顯升高，且與HBVDNA拷貝數(shù)呈正相關(guān)，CD8+T淋巴細(xì)胞的含量與HBVDNA拷貝數(shù)呈負(fù)相關(guān)，CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖功能與PD-1表達水平呈負(fù)相關(guān)［25］，PD-L1在 PBMCs中的表達水平也較正常對照者顯著升高，阻斷PD-1/PD-L1通路后，HBV特異性CD8+T細(xì)胞的功能得到改善［26］。將HBV特異性CTL移植入HBV轉(zhuǎn)基因小鼠后，這些細(xì)胞迅速被誘導(dǎo)分泌IFN-γ，但其分泌功能很快就被抑制，并伴隨PD-1表達上調(diào)，利用mAb阻斷PD-L1后，肝內(nèi)特異性CTL數(shù)量增加，分泌 IFN-γ的時間延長［27］。而對HBV急性感染的研究表明，感染清除的患者體內(nèi)病毒特異性的CD8+記憶性T淋巴細(xì)胞PD-1和CD38的表達下調(diào)，開始表達CD127，同時血清轉(zhuǎn)氨酶濃度降低，病毒被機體清除。因此認(rèn)為PD-1是調(diào)節(jié)抗HBV特異性T細(xì)胞免疫的關(guān)鍵分子。上述研究均從不同的角度反映PD-1/PD-L1通路與乙肝病毒感染后的細(xì)胞免疫功能密切相關(guān)，并導(dǎo)致病毒在體內(nèi)持續(xù)存在。

4 結(jié)語

在有效的抗病毒免疫應(yīng)答和自身免疫耐受所需的刺激和抑制信號之間，PD-1/PD-L1信號通路至關(guān)重要，已在體外細(xì)胞培養(yǎng)中強有力地證實，封閉PD-1/PD-L1通路能有效恢復(fù)抗原特異性CTL功能，清除感染病毒。當(dāng)然，由于肝臟組織中的PD-1及其配體的表達情況尚未檢測，故目前尚無證據(jù)證明肝內(nèi)相關(guān)細(xì)胞的PD-1、PD-L1表達情況及其所代表的臨床意義，目前只能通過分析HBV感染后抗原特異性T淋巴細(xì)胞的抑制分子PD-1表達水平及其對T細(xì)胞功能的免疫調(diào)節(jié)作用了解HBV感染慢性化的機制并預(yù)測病情的轉(zhuǎn)歸。研究如何通過阻斷PD-1/PD-L1抑制性信號途徑來實現(xiàn)增強抗病毒特異性T細(xì)胞的功能，對于治療慢性HBV感染和打破免疫耐受都有重要的意義。盡管該信號通路還有許多尚不明確的環(huán)節(jié)有待解決，隨著不斷深入研究，其與抗病毒免疫的關(guān)系逐步闡明，該信號很有可能成為慢性乙型肝炎抗病毒治療的主要靶位。

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