2，4，6-三硝基苯磺酸誘導雛雞潰瘍性結(jié)腸炎模型的建立

于志強，周　英，鄭世民

(東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，哈爾濱 150030)

2，4，6-三硝基苯磺酸誘導雛雞潰瘍性結(jié)腸炎模型的建立

于志強，周英，鄭世民*

(東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，哈爾濱 150030)

為探索動物潰瘍性腸炎的發(fā)生發(fā)展機制及其對機體的影響，以10日齡SPF雛雞為研究對象，以2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)為誘導劑，分別根據(jù)體重應用50、100、150 mg·kg-1的TNBS(50%乙醇稀釋)通過灌腸途經(jīng)建立TNBS誘導的雛雞潰瘍性結(jié)腸炎動物模型，進而分析TNBS對雛雞潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生的劑量效應。并對TNBS所致的潰瘍性結(jié)腸炎雛雞的臨診癥狀、眼觀和病理組織以及體重等變化進行較全面系統(tǒng)的觀察或檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，100 mg·kg-1TNBS為制備雛雞潰瘍性結(jié)腸炎動物模型的理想給藥劑量，其能夠得到理想的實驗動物臨診癥狀和病理變化，同時對雛雞的損傷在可控范圍內(nèi)，不會造成模型動物的大批死亡。本研究成功建立雛雞潰瘍性結(jié)腸炎病理模型，為進一步研究潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

2，4，6-三硝基苯磺酸；雛雞；潰瘍性結(jié)腸炎

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是炎癥性腸病的一種，是一種慢性非特異性結(jié)腸炎癥，病變主要位于結(jié)腸的黏膜層，且以潰瘍?yōu)橹?，多累及直腸和遠端結(jié)腸，同時可向近端擴展，以至遍及整個結(jié)腸[1-2]。潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病因素包括飲食因素、環(huán)境因素、免疫因素和遺傳因素，在人類還包括心理與精神狀態(tài)[3-9]。綜合國內(nèi)外對該項的已有研究資料，雖然對其發(fā)生機制和可能引發(fā)原因等進行了大量研究，但對其具體發(fā)病原因及其機制至今仍然不十分清楚[10-11]。現(xiàn)階段，對于應用2，4，6-三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)作為誘導劑制備潰瘍性結(jié)腸炎模型的研究主要集中于對該病致病機制和治療藥物的研究[12-15]，并且相關(guān)研究主要集中于哺乳動物。而應用TNBS對禽類所致的潰瘍性結(jié)腸炎的研究迄今未見報道。合理選擇理想的動物模型，對研究潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。探索禽類潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機制，可為比較醫(yī)學研究人類潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生和其防治提供重要的參考依據(jù)。

綜合目前對該領(lǐng)域的已有研究報道，潰瘍性結(jié)腸炎動物模型的制作方法歸納如下：(1)自發(fā)性動物模型；(2)化學藥物誘導的動物模型；(3)基因型動物模型；(4)細胞移植型動物模型；(5)化學藥物與免疫復合物聯(lián)合誘導動物模型?；瘜W藥物誘導的動物模型被認為是更加符合免疫作用導致的炎癥性腸病。其中應用TNBS誘導的潰瘍性結(jié)腸炎已成為最常用的潰瘍性結(jié)腸炎動物模型的制作方法[16]。對本項研究以10日齡SPF雛雞為研究對象，以TNBS為刺激劑，在成功建立禽潰瘍性結(jié)腸炎動物模型的基礎(chǔ)上，并對潰瘍性結(jié)腸炎雛雞的臨診癥狀、主要器官組織的眼觀和病理組織及其體重等變化進行了較全面系統(tǒng)的研究。為進一步研究潰瘍性結(jié)腸炎的分子發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實驗動物

10日齡CSIRO-MVS品種SPF雛雞，購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF雛雞實驗動物中心，并提供飼養(yǎng)。

1.2主要試劑和儀器

2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)，德國Sigma公司產(chǎn)品；蘇木色精，上海試一化學試劑有限公司產(chǎn)品；曙紅B，新中化學廠股份有限公司產(chǎn)品；H600L顯微成像系統(tǒng)，日本NiKon公司產(chǎn)品；HM340E切片機，德國Thermo公司產(chǎn)品。

1.3實驗動物分組及處理

將84只SPF雛雞隨機分為4 組，即對照組(簡稱C)、50 mg·kg-1的 TNBS組(簡稱M1)，100 mg·kg-1的 TNBS組(簡稱M2)和150 mg·kg-1的 TNBS組(簡稱M3)，每組21只雛雞。其中，C組雛雞以50%乙醇溶液灌腸1次；M1、M2和M3三組雛雞分別通過泄殖腔給予經(jīng)50%乙醇稀釋的50、100、150 mg·kg-1的TNBS溶液。

1.4雛雞潰瘍性結(jié)腸炎模型制備

取上述10日齡SPF雛雞，灌腸前禁食24 h，飲水正常供給，將雛雞由腿部和翅膀進行保定，然后倒立，即雛雞肛門朝上，用微量吸管將1.0 mL TNBS乙醇稀釋液由雛雞肛門灌入，待藥液完全注入雛雞腸腔后，輕輕抽出吸管，并繼續(xù)保持雛雞倒立姿勢1～2 min，讓藥液在腸道中有充分的停留時間。藥物灌腸后根據(jù)雛雞臨診癥狀、糞便(性狀、潛血)以及體重等變化初步判斷雛雞是否造模成功。

1.5被檢材料采取及其處理

四組雛雞分別于50%乙醇或TNBS乙醇稀釋液灌腸后的當天開始觀察并記錄雛雞體重變化及其臨診癥狀，并于藥液灌腸后1、3、4、6、8、10和14 d，每組分別隨機抽取3只雛雞經(jīng)心臟采血處死或發(fā)病死亡前剖殺，采集雛雞結(jié)腸組織經(jīng)適當處理后備用。

1.6檢測指標及方法

1.6.1潰瘍性結(jié)腸炎雛雞臨診主要癥狀觀察常規(guī)法，項目包括：雛雞精神狀態(tài)、飲食和飲水、背羽變化、糞便(性狀、潛血)以及體重變化等。

1.6.2潰瘍性結(jié)腸炎雛雞腸道病理損傷評分雛雞結(jié)腸組織進行眼觀病理變化觀察，根據(jù)腸粘連、潰瘍形成及炎癥程度進行評分(表1)，然后取遠端結(jié)腸一段置于預先裝有4%多聚甲醛液的磨口瓶中固定，室溫至少固定24 h，并編號。

1.6.3眼觀病理變化觀察雛雞心臟采血處死或自然死亡后，剖開雛雞腹腔觀察結(jié)腸粘連情況后，取出結(jié)腸，剖開結(jié)腸觀察其黏膜的病理變化(包括充血、潰瘍灶及腸壁厚薄等)。

1.6.4病理組織變化檢查取出于4%甲醛溶液固定的組織塊，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，光學顯微鏡下進行病理組織學觀察。

2　結(jié)　果

2.1TNBS潰瘍性結(jié)腸雛雞的臨診主要癥狀

TNBS乙醇稀釋液給雛雞灌腸后1 h，所有試驗組雛雞均呈現(xiàn)喜臥、少動，精神沉郁。1 d后進食和飲水量明顯減少，背羽凌亂、無光澤，體重下降等現(xiàn)象，呈現(xiàn)里急后重癥狀。4 d時雛雞癥狀最為嚴重。其中M3組雛雞可見泄殖腔口周邊羽毛被糞便污染，并伴有便血等，同時出現(xiàn)死亡。藥物灌腸后6 d，M1組和M2組雛雞癥狀有所好轉(zhuǎn)，而M3組雛雞雖然癥狀相對也有所減輕，但其減輕程度仍然沒有M1和M2組雛雞明顯。

表1潰瘍性結(jié)腸炎雛雞腸道眼觀病理損傷評分標準

Table 1The standard of eye view pathological damage of chicks of ulcerative colitis

主要病變Mainlesions病理損傷具體判斷標準Criteriaofpathologicallesion記分Score粘連Adhesion無輕度(結(jié)腸與其他組織易剝離)重度(結(jié)腸與其他組織不易剝離)012潰瘍形成及炎癥Ulcerandinflammation無局部組織充血，但無潰瘍腸壁增厚，并有1處潰瘍腸壁增厚，局部組織炎癥反應帶明顯并有1處潰瘍局部組織炎癥反應帶明顯并有2及以上潰瘍潰瘍和/或炎癥2cm，病變范圍每增加1cm，積分加101234

2.2TNBS乙醇稀釋液灌腸對雛雞體重的影響

TNBS乙醇稀釋液給雛雞灌腸后3～14 d，無論是高劑量還是低劑量模型雛雞體重均分別不同程度低于相應對照雛雞(P<0.05或P<0.01)。其余未見統(tǒng)計學差異(P>0.05)(圖1)。

圖1　TNBS對雛雞體重的影響Fig.1　The effect of weight of chicks by TNBS

2.3TNBS乙醇稀釋液灌腸雛雞腸道病理損傷評分

用TNBS乙醇稀釋液給雛雞灌腸后1 d，所有試驗雛雞的結(jié)腸黏膜均出現(xiàn)充血，但未見潰瘍灶；3 d，M2和M3組雛雞的結(jié)腸黏膜均發(fā)現(xiàn)1處潰瘍灶，同時伴有腸壁增厚，腸腔增大等癥狀，可見局部組織的不同程度粘連；而M1組雛雞盡管結(jié)腸黏膜也出現(xiàn)1處潰瘍，但未見組織粘連現(xiàn)象；4 d，M2和M3組雛雞的結(jié)腸黏膜不但潰瘍灶數(shù)量增加而且其炎癥癥狀也明顯加重，且M3組雛雞腸黏膜的粘連程度也更加顯著；6 d，各試驗組雛雞的臨診癥狀均出現(xiàn)程度不同的好轉(zhuǎn)，其中M3組雛雞結(jié)腸黏膜的上述癥狀減輕尤為明顯，M2組雛雞結(jié)腸黏膜僅剩1處潰瘍灶、炎癥和黏膜粘連現(xiàn)象均開始逐漸消失，M1組雛雞結(jié)腸黏膜潰瘍灶消失，僅見局部充血；8 d，各試驗組雛雞的所有上述表現(xiàn)均繼續(xù)好轉(zhuǎn)，癥狀進一步減輕，至14 d所有試驗組雛雞均基本痊愈。對照雛雞除于乙醇灌腸后1～4 d，其結(jié)腸黏膜僅出現(xiàn)一過性局部充血，并于6 d轉(zhuǎn)歸并痊愈外，其余未見異常。

表2TNBS雛雞腸道病理變化評分

Table 2The score of the pathological changes in intestinal tract of chicks by clystering with TNBS

組別GroupTNBS灌腸后不同時間的腸道病理變化評分ScoreofthepathologicalchangesdifferentdayafterclysteringwithTNBS1d3d4d6d8d10d14dC組1110000M1組1221000M2組1452100M3組1473210

2.4TNBS灌腸雛雞結(jié)腸眼觀病理變化

用TNBS乙醇稀釋液給雛雞灌腸后，M1組雛雞在3 d時，其結(jié)腸黏膜可見1處潰瘍灶；而M2和M3組雛雞腸道除均可見局部充血、腸壁增厚、腸腔增大、且伴有潰瘍外，并呈現(xiàn)不同程度的粘連；M3組雛雞上述癥狀較M1組和M2組雛雞更加嚴重。以上病理變化一直持續(xù)至灌腸后10 d，14 d時癥狀開始減輕或消失。對照雛雞除乙醇灌腸后的早期可見腸黏膜局部呈現(xiàn)一過性充血外，其余未見異常(圖2)。

2.5TNBS灌腸雛雞結(jié)腸的病理組織變化

用TNBS乙醇稀釋液給雛雞灌腸后，各試驗組雛雞的結(jié)腸病理組織光學顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)：M2和M3組雛雞結(jié)腸組織均普遍增厚，腺管扭曲、排列不整齊，腸上皮隱窩破壞并可見膿腫，杯狀細胞顯著減少，腸黏膜固有層增厚，大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，黏膜下層水腫。M1組雛雞上述病理變化較M2和M3組雛雞輕微。而對照雛雞的結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)較清晰，上皮完整，杯狀細胞豐富，腺管結(jié)構(gòu)未見異常(圖3)。

圖2　TNBS灌腸后雛雞結(jié)腸眼觀病理變化Fig.2　The changes of eye view pathology in colon of chicks by clystering with TNBS

圖3　TNBS灌腸后雛雞結(jié)腸的病理組織變化(10×40)Fig.3　The changes of histopathology in colon of chicks by clystering with TNBS(10×40)

3　討　論

本研究發(fā)現(xiàn)，用不同劑量的TNBS乙醇稀釋液經(jīng)由雛雞泄殖腔灌腸后，各試驗組雛雞均表現(xiàn)出了不同程度的臨診癥狀，其中，劑量在100 mg·kg-1體重及其以上時，M2和M3組雛雞均出現(xiàn)進食和飲水量減少，體重下降，背羽凌亂、無光澤以及腹瀉等主要臨診癥狀。且較大劑量的M3組雛雞甚至出現(xiàn)大量便血，部分雛雞最終因衰竭而導致死亡。而劑量為50 mg·kg-1的M1組雛雞，其臨診癥狀相對較輕，病程更短，對機體的損傷較小，恢復也較快，個別雛雞甚至不表現(xiàn)明顯的臨診癥狀。

眼觀病理變化觀察發(fā)現(xiàn)，TNBS乙醇稀釋液給雛雞灌腸后1 d，其所有試驗組雛雞的結(jié)腸黏膜均出現(xiàn)局部充血等炎癥癥狀。3 d，可見M2和M3組雛雞腸道黏膜不同程度粘連，局部充血，腸壁增厚，腸腔增大，并且伴有潰瘍，M1組雛雞結(jié)腸黏膜變化較輕微，除僅出現(xiàn)1處潰瘍外，未見腸粘連。4 d，M2和M3組雛雞病理變化進一步加重。6 d，各試驗組雛雞開始逐漸好轉(zhuǎn)，結(jié)腸黏膜炎癥變化較之前減輕。14 d，各試驗組雛雞均基本痊愈。產(chǎn)生以上變化的原因可能是，由于M2和M3組雛雞應用TNBS乙醇稀釋液劑量較大，在乙醇對雛雞腸黏膜作用后，作為半抗原的TNBS能夠充分與損傷的腸道上皮細胞中的賴氨酸共價結(jié)合，進而轉(zhuǎn)變成完全抗原，促進致炎因子的表達和釋放，進而促進炎癥的發(fā)生，加重腸黏膜的損傷。M1組雛雞由于應用TNBS的劑量較小，對腸黏膜損傷程度低，TNBS與損傷的腸道上皮細胞接觸不充分，不能轉(zhuǎn)變成完全抗原，結(jié)果不足以引發(fā)機體產(chǎn)生過敏反應而誘發(fā)炎癥性損傷。陳佳奇等[17]以小鼠為研究對象，依然以TNBS為誘導劑，復制小鼠潰瘍性結(jié)腸炎動物模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNBS所誘導的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎病程較長，呈慢性型。而本試驗以SPF雛雞為研究動物，所復制的TNBS雛雞潰瘍性結(jié)腸炎模型為急性型，這一研究結(jié)果，不僅表明雛雞較小鼠對TNBS更敏感，同時也提示TNBS所致的潰瘍性結(jié)腸炎可能存在一定的動物種屬差異，其具體情況有待進一步探討。

病理組織變化檢查發(fā)現(xiàn)，M2和M3組雛雞的結(jié)腸組織均增厚、腺管扭曲、排列不整齊，杯狀細胞顯著減少，黏膜固有層增厚、大量中性粒細胞，淋巴細胞浸潤，黏膜下層水腫，黏膜上皮隱窩被破壞、膿腫形成。10 d后上述病理組織變化逐漸減輕甚至消失，產(chǎn)生此病理改變，可能與TNBS作為抗原物質(zhì)引發(fā)機體免疫反應密切相關(guān)。應用TNBS乙醇混合液灌腸后，其中的乙醇能夠刺激并損傷腸黏膜，使雛雞腸黏膜的屏障功能受到不同程度的損傷，結(jié)果導致TNBS可以直接作用于腸道上皮細胞，作為異種抗原引發(fā)機體發(fā)生過敏反應，降低機體腸道局部黏膜的免疫功能，使腸道內(nèi)致病菌更容易在腸道內(nèi)定植，并產(chǎn)生毒素能夠促進炎癥細胞在腸黏膜上聚集，激活T淋巴細胞，使TNF-α mRNA表達增加，TNF-α能夠活化核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)，后者的活化又能啟動TNF-α基因轉(zhuǎn)錄，使TNF-α分泌進一步增多，形成級聯(lián)反應[18-19]，同時誘導多種促炎因子，如IL-6、IL-1和IL-8等過表達，從而放大炎癥效應，誘發(fā)或加重炎癥損傷[20-22]。丁偉群等[23]研究表明，潰瘍性結(jié)腸炎所致的組織損傷引起的急性炎癥在很大程度上是由TNF-α和IL-1b造成的。而從M1組雛雞結(jié)腸的病理組織變化可以看出腸道上皮僅出現(xiàn)輕微的組織增厚和中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，于6 d后病理變化基本消失，造成上述變化的可能原因與灌腸時機械性作用和化學刺激密切相關(guān)。

4　結(jié)　論

100 mg·kg-1的2，4，6-三硝基苯磺酸為制備雛雞潰瘍性結(jié)腸炎的理想給藥劑量，該劑量不僅能夠觀察到理想模型動物的主要臨診癥狀和病理變化，而且對雛雞的損傷也在可控范圍內(nèi)，更重要的是不會導致模型動物的大批死亡。

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(編輯白永平)

Development of Ulcerative Colitis Models Induced by 2，4，6-trinitrobenzene Sulfonic Acid in Chicks

YU Zhi-qiang，ZHOU Ying，ZHENG Shi-min*

(CollegeofVeterinaryMedicine，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China)

In order to explore the mechanisms of ulcerative colitis in animals and its impact on body，10-day-old SPF chicks were used to build 2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS) -induced model by clystering with TNBS in dose of 50，100，and 150 mg·kg-1，diluting with 50% ethanol，that can help us to analyzes the dose effect of TNBS-induced ulcerative colitis.Further observation and testing about the changes of the chicks’ clinical symptoms，pathology and body weight showed that the ideal medicine dose was 100 mg·kg-1of TNBS，which can induce ideal changes of clinical symptoms and pathology in experimental animals without uncontrolled injury and massive death.This study successfully established chicks’ pathological model of ulcerative colitis which laid a foundation for deep research of the development of ulcerative colitis.

2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid；SPF chicks；ulcerative colitis

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.027

2014-12-22

國家自然科學基金項目(31472169)

于志強(1986-)，男，黑龍江佳木斯人，博士生，主要從事畜禽免疫病理學研究，E-mail：yzqtd@163.com

*通信作者：鄭世民，教授，E-mail：zhengshiminbl@sohu.com，Tel：0451-55190405

S852.3

A

0366-6964(2015)09-1686-06