金川多肋牦牛Hoxa6和Hoxa10基因甲基化與mRNA差異表達(dá)研究

熊顯榮，張 雁，蘭道亮，李 鍵*，字向東，李善蓉，楊建梅

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041； 3.金川縣獸醫(yī)畜牧局，金川 624100)

金川多肋牦牛Hoxa6和Hoxa10基因甲基化與mRNA差異表達(dá)研究

熊顯榮1#，張 雁1#，蘭道亮2，李 鍵2*，字向東1，李善蓉3，楊建梅3

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041； 3.金川縣獸醫(yī)畜牧局，金川 624100)

本研究旨在通過檢測金川多肋牦牛與普通牦牛中Hoxa6和Hoxa10基因的轉(zhuǎn)錄水平和啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，為揭示Hox基因在金川多肋牦牛多1對肋骨性狀形成中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測Hoxa6和Hoxa10基因在多肋牦牛和普通牦牛中的mRNA表達(dá)水平，同時(shí)采用重亞硫酸鹽測序PCR(Bisulfite-sequencing PCR，BSP)法對Hoxa6和Hoxa10啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行甲基化修飾與克隆測序，分析甲基化狀態(tài)。結(jié)果顯示，多肋牦牛中Hoxa6基因表達(dá)量顯著高于普通牦牛(P<0.05)，而Hoxa10基因表達(dá)量顯著低于普通牦牛(P<0.05)。Hoxa6啟動(dòng)子區(qū)域的CpG2，在普通牦牛中的DNA甲基化顯著高于多肋牦牛(P<0.05)，尤其是第3、4、8、20和21位CpG位點(diǎn)；Hoxa10啟動(dòng)子區(qū)域的CpG1在普通牦牛中的DNA甲基化狀態(tài)顯著低于多肋牦牛(P<0.05)，普通牦牛的第9和12位CpG位點(diǎn)幾乎未甲基化。多肋牦牛中Hoxa10高甲基化在一定程度上抑制了Hoxa10基因的表達(dá)，Hoxa6低甲基化水平促進(jìn)了Hoxa6基因的表達(dá)。啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化在一定程度上影響Hox基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，且與多肋性狀的形成可能存在一定的聯(lián)系。

牦牛；Hox基因；甲基化；表達(dá)

牦牛(Bosgrunniens)是主要分布于中國青藏高原及其毗鄰地區(qū)的一個(gè)特有且珍貴的畜種，其對高寒草地生態(tài)環(huán)境具有良好的適應(yīng)能力，能在低氧、嚴(yán)寒、強(qiáng)紫外線輻射的高原惡劣環(huán)境條件下生存和繁衍后代，并為當(dāng)?shù)啬撩裉峁┤?、肉等畜產(chǎn)品、作為運(yùn)輸工具等生產(chǎn)和生活必需品，是當(dāng)?shù)啬撩竦闹饕?jīng)濟(jì)來源[1]。此外，在遺傳上也是一個(gè)極為寶貴的基因庫。目前，依據(jù)牦牛的起源地、外貌、形態(tài)結(jié)構(gòu)、生產(chǎn)性能、線粒體DNA以及所處地理環(huán)境特點(diǎn)，已認(rèn)定了大通牦牛、天祝牦牛、九龍牦牛、麥洼牦牛等多個(gè)地方品種[2]。金川多肋牦牛主要分布于四川省阿壩藏族羌族自治州金川縣，擁有15對肋骨，比普通牦牛多1對肋骨，而且具有產(chǎn)肉、產(chǎn)奶量高，性成熟早、繁殖性能高、遺傳穩(wěn)定、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)良生產(chǎn)性能和生物學(xué)特性[3]。因此，開展金川多肋牦牛遺傳資源的保護(hù)與開發(fā)具有重要的經(jīng)濟(jì)和科學(xué)價(jià)值，研究其生長發(fā)育及其調(diào)控機(jī)理對充分發(fā)揮優(yōu)良特性和促進(jìn)牧區(qū)發(fā)展具有重要意義。

肋骨數(shù)與生產(chǎn)性、抗逆性等密切相關(guān)，在多椎骨蒙古羊的研究中也有報(bào)道[4]。研究表明，蒙古羊的多椎骨形成與Hox簇(Homeobox)基因有關(guān)。Hox簇基因最早在果蠅中發(fā)現(xiàn)[5]，是一類專門調(diào)控生物體形發(fā)育的基因，進(jìn)化上相對保守，決定著動(dòng)物的體節(jié)與椎骨的位置、形態(tài)和數(shù)量[6]。大多數(shù)脊椎動(dòng)物的Hox基因有4個(gè)連鎖群，即Hoxa、Hoxb、Hoxc、Hoxd，分別位于第7、17、2、12 號染色體上，各自有 13個(gè)基因位點(diǎn)[7]。M.Kmita等研究表明，Hoxa和Hoxd 在調(diào)節(jié)軀體形成中起重要作用，而Hoxb和Hoxc只起細(xì)微調(diào)節(jié)作用[8]。哺乳類動(dòng)物的細(xì)胞分化高度復(fù)雜，因此需要4個(gè)Hox基因簇以不同形式產(chǎn)生足夠種類的Hox基因組合，但是Hox基因的功能在多大程度上依賴于這種組合仍不確定[9-10]。Hox基因的突變會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物脊椎的數(shù)量或在不同位置椎骨形態(tài)發(fā)生變異。小鼠的Hox8突變可導(dǎo)致胸椎增加一枚，并且肋骨多長1對[11-12]；趙靜等研究烏珠穆沁旗蒙古羊時(shí)發(fā)現(xiàn)，多胸椎蒙古羊的Hoxc8基因表達(dá)異常[4]。以上研究結(jié)果表明，Hox家簇基因與哺乳動(dòng)物的體軸骨架以及附屬骨的形成息息相關(guān)。此外，以小鼠為模式動(dòng)物，將Hoxa10基因敲除后發(fā)現(xiàn)，腰椎骨消失且肋骨一直延伸到尾椎骨。同時(shí)，Hoxa10發(fā)生變異后，小鼠的肋骨數(shù)也由13對增加到14對，且骶骨的形成過程也發(fā)生改變[13]。D.Kostic等研究顯示，雜合的Hoxa6小鼠的椎骨形成異常[14]。然而，有關(guān)金川多肋牦牛的形成機(jī)制和分子機(jī)理至今仍未弄清楚。

DNA甲基化是DNA在復(fù)制后由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyl-transferase，Dnmt)催化，將S-腺苷甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶第5位C上而形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。在基因組DNA序列沒有發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)發(fā)生改變且可以遺傳，導(dǎo)致可遺傳的表型變化[15]。DNA甲基化與生物體內(nèi)重要基因的表達(dá)調(diào)節(jié)有緊密聯(lián)系，目前研究結(jié)果表明，DNA甲基化一般與基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化與基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，結(jié)構(gòu)基因內(nèi)部的甲基化與基因表達(dá)也存在著一定的負(fù)相關(guān)，而啟動(dòng)子區(qū)低甲基化與轉(zhuǎn)錄活性正相關(guān)[16]。

因此，本研究以金川多肋牦牛為研究對象，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測Hoxa6和Hoxa10基因在金川多肋牦牛(15對)及普通牦牛(14對)中的表達(dá)差異；利用重亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite-sequencing PCR，BSP)檢測金川多肋牦牛中Hoxa6和Hoxa10基因的甲基化狀態(tài)，從表觀遺傳學(xué)角度分析Hoxa6和Hoxa10基因與金川多肋牦牛的聯(lián)系。旨在為進(jìn)一步揭示Hox基因?qū)鸫ǘ嗬哧笈ＩL發(fā)育、胚胎骨骼發(fā)育等的作用，以及建立有效可靠的分子標(biāo)記等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司；膠回收及質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司；Trizol 購自Invitrogen公司；基因組DNA修飾試劑盒購自Gepigentek公司；熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀、電泳儀、瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司；引物由上海英駿公司合成。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

牦牛組織樣品均采集于四川省阿壩州金川縣，試驗(yàn)動(dòng)物為健康的空懷期成年母牦牛(3歲左右)，屠宰后立即采集普通牦牛和多肋牦牛(各5頭)的血液和組織。采集的血液樣本置于RNA保護(hù)液中保存，組織樣品立即置于液氮中保存，用于提取基因組DNA和總RNA。

1.3 基因組DNA的提取

參照說明書，用Tissue DNA Kit(Omega)提取多肋牦牛和普通牦?；蚪MDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

利用Trizol試劑盒提取血液、腎和肺組織樣本的總RNA。并用RNase-free的DNase I處理，以去除DNA污染。RNA的質(zhì)量和含量通過Nanodrop ND-1000檢測吸光度A260 nm/A280 nm進(jìn)行測定，完整性通過1.5%(w/v) 凝膠電泳進(jìn)行檢測。取2 μL(1 μg·μL-1)RNA，0.5 μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，0.5 μL oligo(dT)18，2 μL Buffer，及DEPC水至10 μL，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.5 qRT-PCR 定量分析Hoxa6和Hoxa10表達(dá)

本試驗(yàn)以Hoxa6和Hoxa10為研究對象，以管家基因GAPDH為內(nèi)參分析目的基因的相對表達(dá)水平。根據(jù)本課題組前期獲得的RNA序列，用Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物均需跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)，具體引物序列見表1。采用SYBR Green Ⅱ熒光定量PCR法分析多肋牦牛與普通牦牛Hoxa6和Hoxa10基因的mRNA相對表達(dá)豐度。所有反應(yīng)均重復(fù)3次，20 μL反應(yīng)體系：10 μL 2×SYBR Green premix，上、下游引物各0.8 μL(10 pmol·mL-1)，模板2 μL 以及DEPC水6.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，最佳Tm 10 s，72 ℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)。65～95 ℃每隔 0.5 ℃讀板一次，繪制熔解曲線。分析各基因的熔解曲線并電泳鑒定PCR產(chǎn)物。結(jié)果采用2-△△Ct法對目的基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行相對定量分析。

1.6Hoxa6和Hoxa10基因5′端序列的克隆

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已公布牛的Hoxa6(NW_005394721.1)和Hoxa10(NW_005394721.1)基因DNA序列，對目的基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(Transcription start sites，TSS)上游2 000 bp設(shè)計(jì)兩對引物Hoxa6-p和Hoxa10-p，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Vector(TaKaRa)載體上，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α。挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，陽性克隆送華大基因公司測序。

1.7 CpG島的預(yù)測與引物設(shè)計(jì)

對目的基因Hoxa6和Hoxa10轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS，+1)前后的序列(-2 000～+2 000 bp)進(jìn)行甲基化CpG島的預(yù)測，預(yù)測結(jié)果見圖1。在Hoxa6啟動(dòng)子區(qū)域選擇一段長205 bp的CpG2作為研究對象，該區(qū)域有21個(gè)CpG位點(diǎn)；在Hoxa10啟動(dòng)子區(qū)域選擇一段長177 bp的CpG1作為研究對象，該區(qū)域有15個(gè)CpG位點(diǎn)；上面一排為目的基因原序列，下面一排為重亞硫酸氫鹽處理后的序列，可見下面一排序列中除CpG位點(diǎn)外的C都轉(zhuǎn)化為了T，方框區(qū)域?yàn)橐?，具體見圖1。

1.8 DNA 的重亞硫酸鹽處理

采用甲基化試劑盒對DNA進(jìn)行修飾，詳細(xì)步驟參見試劑盒說明書，獲得修飾后的DNA。取修飾后DNA作為模板進(jìn)行BSP擴(kuò)增反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系為50 μL：Zymo TaqTMPremix 25 μL，上、下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)，模板4 μL，ddH2O 19 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，最佳Tm 40 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min；4 ℃ 30 min。將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T Vector載體，并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞。從平板上隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，每個(gè)轉(zhuǎn)化板至少挑10個(gè)陽性克隆送華大基因公司測序。測序結(jié)果通過Bioanalyzer軟件進(jìn)行處理與分析。

表1 引物序列及 PCR反應(yīng)條件

Table 1 Primer sequences and PCR reaction conditions

名稱Name引物序列(5′?3′)Primersequence位置/bpPosition產(chǎn)物長度/bpProductsize退火溫度/℃AnnealingtemperatureHoxa6?pF：CTGTCATCTGATGGCGTTGTR：CTGCAGGACTGTGATTTGTTGT-2069～-2050-14～-35205657Hoxa10?pF：TATGGGCTGCAGAGCTGCR：CAGTTGGCTGCGTTTTCG-1980～-196310～-8199057Hoxa6?qF：GGCAGTGGCAAACAGAGGR：CAGGTAGCGGTTGAAGTGG293～310559～54126758Hoxa10?qF：GCCTTTGTTCGCTTCTGATTR：GCGTCTGGTGCTTGGTGTA19～218492～47429457Gapdh?qF：TGGTGCTGAGTATGTGGTGGR：TCTTCTGGGTGGCAGTGATG373～392662～64329059Hoxa6?BF：GTAAAAGGGAAGGAGTAAAGAGR：AAATTACAAACAACCCCCAATC-405～-384-201～-22220554．6Hoxa10?BF：GTAGAATATTAAAGAGGAGAGR：CCCTTAATAATACCATAAACC-1695～-1675-1519～-153917753．4

p.RT-PCR；q.qRT-PCR；B.BSP

p，q and B represent RT-PCR，qRT-PCR and BSP，respectively

1.9 統(tǒng)計(jì)與分析

所有組別的試驗(yàn)都至少重復(fù)3次。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。mRNA相對表達(dá)豐度等采用ANOVA方差分析和Tukey′s LSD檢驗(yàn)，所有結(jié)果當(dāng)P<0.05時(shí)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)”表示。

圖1 Hoxa6和Hoxa10結(jié)構(gòu)及BSP擴(kuò)增區(qū)域示意圖Fig.1 The schematic diagram of Hoxa6 and Hoxa10 and the regions amplified by BSP

2 結(jié) 果

2.1 牦牛Hoxa6和Hoxa10基因 5′端序列特征

以黃牛Hoxa6 (NW_005394721.1)和Hoxa10(NW_005394721.1)基因DNA序列為參照設(shè)計(jì)引物，分別擴(kuò)增5′端序列，電泳圖譜如圖2(泳道1、2) 所示。經(jīng)過克隆測序和序列分析獲得了牦牛Hoxa6和Hoxa10 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游部分序列，總長分別為 2 056和1 990 bp，經(jīng)BLAST分析，與黃牛序列的同源性為97.5%和96.4%。牦牛Hoxa6轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游部分序列中A、T、G、C等4種堿基的含量分別為 23.2%、24.4%、26.1%和 26.3%，其中A+T含量(47.6%)小于G+C含量(52.4%)。牦牛Hoxa10轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游部分序列中A、T、G、C等4種堿基的含量分別為24.6%、23.7%、27.0%和 24.7%，其中A+T含量(48.3%)小于G+C含量(51.7%)。

2.2Hoxa6和Hoxa10基因 mRNA表達(dá)水平

熒光定量的擴(kuò)增曲線和熔解曲線見圖3。結(jié)果表明，Hoxa6在多肋牦牛中表達(dá)量顯著高于普通牦牛(P<0.05)，其中在多肋牦牛的腎中表達(dá)量最高。然而，Hoxa10在普通牦牛中表達(dá)量顯著高于多肋牦牛(P<0.05)，其中在普通牦牛的肺組織中表達(dá)量最高，其次是血液(圖4)。

M1、M2均表示DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.Hoxa6 5′端；2.Hoxa10 5′端；3～12.重亞硫酸鹽處理后的Hoxa6(上)和 Hoxa10(下)亞克隆菌液PCR產(chǎn)物M1 and M2 represent DNA markers；1 and 2 represent the 5′flanking of Hoxa6 and Hoxa10，respectively；3 to 12 represent the subcloning bacteria PCR products of Hoxa6 and Hoxa10 after bisulfite treatment圖2 PCR擴(kuò)增片段瓊脂糖電泳Fig.2 Representative gel photograph of PCR-amplified fragments

圖3 qRT-PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線Fig.3 The amplification and melt curves of qRT-PCR

2.3Hoxa6和Hoxa10基因甲基化水平

經(jīng)菌液PCR鑒定，陽性克隆(圖2，2～12泳道)進(jìn)行測序。BSP結(jié)果顯示，Hoxa6啟動(dòng)子區(qū)域的CpG2在普通牦牛血液中DNA甲基化狀態(tài)(34.76%，73/210)顯著高于多肋牦牛(17.14%，36/210)(P<0.05)，尤其是第3、4、8、20和21 位CpG位點(diǎn)。Hoxa10啟動(dòng)子區(qū)域的CpG1在普通牦牛血液中DNA甲基化狀態(tài)(22.0%，33/150)顯著低于多肋牦牛(38.0%，57/150)(P<0.05)，普通牦牛的第9和12位CpG位點(diǎn)幾乎未甲基化，而在多肋牦牛中甲基化程度較高(圖5)。

3 討 論

金川多肋牦牛的多肋性狀具有巨大的應(yīng)用價(jià)值和科學(xué)研究意義，但是迄今為止仍未揭開多肋的形成機(jī)制以及表觀遺傳。本研究從表觀遺傳和基因表達(dá)角度探索金川多肋牦牛的分子發(fā)育遺傳機(jī)制。結(jié)果表明，Hoxa6和Hoxa10在多肋牦牛和普通牦牛之間呈拮抗式表達(dá)，而啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)剛好相反。

*.表示差異顯著*.Represents significant difference圖4 多肋牦牛與普通牦牛組織Hoxa6和Hoxa10基因的表達(dá)水平Fig.4 Hoxa6 and Hoxa10 mRNA expression differences between multi-costa and common yaks

(A).Hoxa6和Hoxa10的BSP測序結(jié)果圖：每行代表一個(gè)克隆，黑圈代表甲基化的 CpG 位點(diǎn)，白圈代表未被甲基化的 CpG 位點(diǎn)。(B).Hoxa6和Hoxa10甲基化統(tǒng)計(jì)圖：不同字母(a和b)表示差異顯著(A).Bisulfite sequencing results for multi-costa and common yaks：Each line represents an individual bacterial clone which was sequenced；Filled circles indicate methylated CpG sites；Open circles indicate unmethylated CpG sites.(B).Methylation charts of Hoxa6 and Hoxa10：Different letters(a and b) indicate significant differences圖5 多肋牦牛與普通牦牛血液中 Hoxa6和Hoxa10的甲基化狀態(tài)Fig.5 Hoxa6 and Hoxa10 methylation state in blood of multi-costa and common yaks

Hox基因與脊椎動(dòng)物體軸骨發(fā)生及其基因調(diào)控機(jī)理是從果蠅開始研究的[5]。Hox基因表達(dá)模式的建立和維持具有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，沿染色體的排列順序與沿胚胎前后軸的表達(dá)之間存在空間和時(shí)間上的共線性關(guān)系[17]。Hox基因家簇成員與椎骨形成之間的聯(lián)系已陸續(xù)的得到研究。利用基因敲除法改變Hox基因的DNA分子的堿基序列，可揭示Hox家簇基因的突變導(dǎo)致動(dòng)物脊椎不同位置椎骨形態(tài)與數(shù)量的變異[18-19]。本研究結(jié)果顯示，Hoxa6與Hoxa10的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與T.Vinagre等研究結(jié)果一致，Hoxa6和Hoxa10的表達(dá)改變，使小鼠出現(xiàn)了肋骨增加或抑制肋骨發(fā)育的現(xiàn)象[17]。Hoxa10是通過調(diào)控胸廓區(qū)域來規(guī)劃少了肋骨之后的腰區(qū)布局。D.M.Wellik等研究表明，Hoxa10是哺乳動(dòng)物骨架形成必不可少的基因之一，減少Hoxa10的表達(dá)可使小鼠無法形成肋骨[20]。因此推測，Hoxa10表達(dá)量的增加可能是金川牦牛形成多肋的原因之一。此外，Hoxa6與Hoxa10的相互作用也有可能使多肋性狀出現(xiàn)。研究表明，Hoxa10和Hoxa6是通過Myf5/Myf6介導(dǎo)的FGF和PDGF信號通路而相互作用的，Myf5/Myf6是通過影響Hoxa10和Hoxa6的表達(dá)來控制骨架的形成和肋骨數(shù)[17]。然而，是否由于Hoxa10和Hoxa6異常表達(dá)引起的金川牦牛多肋現(xiàn)象需進(jìn)一步深入研究，通過構(gòu)建敲除細(xì)胞系或建立敲除模型驗(yàn)證Hox基因與金川多肋牦牛的相關(guān)性。

DNA甲基化是基因組主要表觀遺傳修飾方式之一，通常參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，并且已知靶序列5′端調(diào)控區(qū)的超甲基化可能與表達(dá)抑制相關(guān)，即甲基化程度越高，表達(dá)活性越低[21]。CpG島的超甲基化往往會(huì)改變基因的表達(dá)模式，導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄失活[22-23]。本研究結(jié)果表明，金川多肋牦牛Hoxa10的甲基化程度顯著高于普通牦牛，這種超甲基化很可能使控制肋骨的基因表達(dá)發(fā)生異常，因此導(dǎo)致多肋性狀的出現(xiàn)。此外，Hoxa6在多肋牦牛中的甲基化水平顯著低于普通牦牛，很可能進(jìn)一步促進(jìn)肋骨形成基因的轉(zhuǎn)錄。D.Kostic等用基因敲除試驗(yàn)表明鼠的Hox6突變可使胸椎增加一個(gè)，隨之肋骨也多生一對[14]。Hox11突變則導(dǎo)致鼠的椎骨增加一枚[24]。N.Di-Poi等發(fā)現(xiàn)，生長分化因子(GDF)基因可能是Hox8基因上游的調(diào)控基因，鼠GDF基因的突變雜合子有 14對肋骨，而突變純合子的胸椎多達(dá) l8 對肋骨，這表明調(diào)節(jié)主軸骨前后形態(tài)的基因不僅僅與Hox基因有關(guān)，與其上游調(diào)控區(qū)域也密切聯(lián)系[25]。因此，推測DNA甲基化抑制了Hoxa10基因的表達(dá)，以及低甲基化促進(jìn)了Hoxa6基因的表達(dá)，從而使得金川多肋牦牛肋骨數(shù)增加一對，而這其中的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究與驗(yàn)證。

本研究中，通過初步分析Hoxa6和Hoxa10基因之間的相互平衡關(guān)系來探討金川多肋牦牛的多肋生物學(xué)現(xiàn)象形成機(jī)制。前期大量研究證實(shí)了Hoxa6和Hoxa10基因分別與腰區(qū)和骶區(qū)骨骼形成之間的相關(guān)性[17]。本研究結(jié)果表明，Hoxa6基因促進(jìn)椎骨和肋骨的形成，而Hoxa10基因的作用相反。在蒙古羊的研究中發(fā)現(xiàn)了明顯的多椎骨現(xiàn)象，且證明與Hox家簇基因有密切聯(lián)系[4]。在金川牦牛的屠宰試驗(yàn)中，我們也發(fā)現(xiàn)了類似的生物學(xué)現(xiàn)象，有部分牦牛的第15對肋骨只有一側(cè)有，另一側(cè)沒有，或者兩側(cè)的肋骨發(fā)育不完全，只有半截。是否由于Hox基因調(diào)控椎骨的發(fā)育和形成，而間接性的支配肋骨的生長發(fā)育還有待進(jìn)一步挖掘。

4 結(jié) 論

本研究利用重亞硫酸氫鹽測序法和實(shí)時(shí)熒光定量法對Hoxa6和Hoxa10基因在多肋牦牛和普通牦牛中的表達(dá)和甲基化水平進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，普通牦牛Hoxa6基因的甲基化水平極顯著高于多肋牦牛，且mRNA 表達(dá)水平低于多肋牦牛；多肋牦牛Hoxa10基因的甲基化水平極顯著高于普通牦牛，且mRNA 表達(dá)水平低于普通牦牛；說明金川多肋牦牛的Hoxa6和Hoxa10基因可能是通過改變DNA甲基化及其mRNA表達(dá)來調(diào)控肋骨的形成過程。

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(編輯 郭云雁)

Differences ofHoxa6 andHoxa10 Methylation Status and mRNA Expression in Multi-costa Properties of Jinchuan Yak

XIONG Xian-rong1#，ZHANG Yan1#，LAN Dao-liang2，LI Jian2*，ZI Xiang-dong1， LI Shan-rong3，YANG Jian-mei3

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China； 2.InstituteofQinghai-TibetanPlateau，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China； 3.AnimalHusbandryandVeterinarianBureauofJinchuan，Jinchuan624100，China)

The transcription level and methylation in promoter regions ofHoxa6 andHoxa10 genes in multi-costa properties and common yak were investigated to explore the mechanism of transcriptional regulation ofHoxgene in the process of multi-costa properties.The mRNA expression leves ofHoxa6 andHoxa10 genes in multi-costa properties and common yak were detected by real-time fluorescence quantitative PCR(qRT-PCR)，and the methylation ofHoxa6 andHoxa10 genes promoter regions were analyzed by bisulfite-sequencing PCR(BSP)，which included modifying，cloning and sequencing the promoter regions.The results showed that the expression level ofHoxa6 gene was significantly higher in multi-costa properties yak than that in common yak(P<0.05)，while the expression level ofHoxa10 gene was significantly lower in multi-costa properties yak(P<0.05).The methylation status of CpG2 island in theHoxa6 promoter region was significantly different between multi-costa properties and common yak，especially on No.3，4，8，20 and 21 CpG sites.However，the methylation status of CpG1 island in theHoxa10 promoter region was significantly higher in multi-costa properties yak than that in common yak(P<0.05)，and there was almost no methylation on No.9 and 12 CpG sites in common yak.All above results suggested that the high DNA hypermethylation ofHoxa10 gene in multi-costa properties yak inhibited the expression ofHoxa10 gene in a certain degree，and the low DNA hypomethylation ofHoxa6 gene enhanced the expression ofHoxa6 gene.It was concluded that methylation inHoxpromoter regions may have some influence on transcription regulation ofHoxgenes，and there may be some correlation with the formation of multi-costa properties.

yak；Hoxgene；methylation；expression

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.007

2014-11-02

國家科技支撐計(jì)劃(2012BAD13B06)；四川省科技支撐計(jì)劃(2014NZ0114)；西南民族大學(xué)牦牛創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助(13CXTD01)

熊顯榮(1984-)，男，江西贛州人，碩士，主要從事牦牛細(xì)胞生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究，E-mail：xianrongxiong@163.com；張 雁(1990-)，女，吉林長春人，碩士，主要從事牦牛遺傳育種研究，E-mail：150115439@qq.com。二者共同并列為第一作者

*通信作者：李 鍵，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事牦牛細(xì)胞生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究，E-mail：jianli_1967@163.com

S823.85；S813.3

A

0366-6964(2015)09-1532-08