雞L-FABP啟動子區(qū)C/EBPα結(jié)合位點的定點突變分析

賀 綦，孫嬰寧，李 輝*，王啟貴

(1.農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150030； 2.黑龍江省普通高等學(xué)校動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，哈爾濱 150030； 3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030； 4.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460)

雞L-FABP啟動子區(qū)C/EBPα結(jié)合位點的定點突變分析

賀 綦1，2，3，孫嬰寧1，2，3，李 輝1，2，3*，王啟貴1，2，4*

(1.農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150030； 2.黑龍江省普通高等學(xué)校動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，哈爾濱 150030； 3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030； 4.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460)

為進一步分析L-FABP啟動子區(qū)域中的C/EBPα結(jié)合位點以確定其在L-FABP轉(zhuǎn)錄中的調(diào)控作用。本研究采用定點突變方法將L-FABP啟動子區(qū)域中的C/EBPα結(jié)合位點進行有效突變。結(jié)果顯示，C/EBPα外源過表達可以抑制L-FABP啟動子活性，突變L-FABP啟動子區(qū)域中C/EBPα結(jié)合位點后L-FABP的啟動子活性明顯升高。這些結(jié)果表明，雞L-FABP基因受到C/EBPα基因負調(diào)控作用，且C/EBPα很可能通過與該位點結(jié)合參與L-FABP的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，為進一步研究C/EBPα在L-FABP基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用提供重要依據(jù)。

雞；L-FABP基因；啟動子；定點突變；C/EBPα基因

肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(Liver-type fatty acid binding protein，L-FABP，F(xiàn)ABP1)屬于脂肪酸結(jié)合蛋白(Fatty acid binding protein，F(xiàn)ABP)家族的成員之一，是一組低分子量(14～15 ku左右)可以結(jié)合長鏈脂肪酸的高保守性胞質(zhì)蛋白。目前，對L-FABP的功能研究主要集中在人與小鼠上[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，L-FABP與不飽和脂肪酸的協(xié)同作用可有效促進細胞的生長和分化[2]。F.Schroeder等[3]研究發(fā)現(xiàn)，L-FABP基因的表達與胚胎干細胞的增殖分化密切相關(guān)。E.P.Newberry等[4]利用基因剔除模型研究顯示，在長期禁食狀態(tài)下，L-FABP基因剔除的小鼠肝對脂肪酸的攝入量少于野生型。

雞L-FABP基因只在肝和小腸中表達[5]，與哺乳動物L-FABP蛋白結(jié)構(gòu)相似[6]。已經(jīng)研究證實，PPAR元件、甾族調(diào)節(jié)元件SRE、C/EBPα和AP1等是人L-FABP基因啟動子的重要順式作用元件[7]。C/EBPα基因是第1個被證明在脂肪細胞分化過程中起到重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。通過在3T3-Ll前脂肪細胞中研究發(fā)現(xiàn)脂肪細胞的分化過程中必須要有C/EBPα。在小鼠體內(nèi)將C/EBPα基因干擾，發(fā)現(xiàn)小鼠的白色脂肪組織發(fā)育停滯[8]。本研究前期對雞L-FABP啟動子進行鑒定與分析，推測其啟動子區(qū)存在1個C/EBPα結(jié)合位點，受到C/EBPα基因負調(diào)控作用[9]。

為進一步分析L-FABP啟動子區(qū)域中C/EBPα結(jié)合位點的真實性和確切位置，本研究采用定點突變的方法對L-FABP啟動子區(qū)域中的C/EBPα結(jié)合位點進行分析，為闡明C/EBPα在L-FABP基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

DMEM高糖培養(yǎng)基、Opti-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Dual-Luciferase?Reporter Assay System)、螢光素酶報告基因載體(pGL3-basic vector)、海腎熒光素酶報告基因載體(pRL-TK vector)購自Promega公司；質(zhì)?；厥赵噭┖匈徸設(shè)miga公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；Fast Mutagenesis System購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；C/EBPα真核表達載體和L-FABP(-2076/-20)質(zhì)粒由本實驗室保存；人肝癌細胞系(HEGP2)由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命學(xué)院惠贈。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 采用Mulan和TFSEARCH 軟件對L-FABP(-2 076/-20)啟動子區(qū)進行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的預(yù)測分析。

1.2.2 定點突變重組體的構(gòu)建 根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果對L-FABP啟動子區(qū)域的C/EBPα結(jié)合位點進行定點突變，設(shè)計C/EBPα結(jié)合位點突變引物并命名為L-FABP-F-mC/EBPα和L-FABP-R-mC/EBPα(表1)。以pGL3-L-FABP(-2 076/-20)質(zhì)粒為模板構(gòu)建突變重組體L-FABP-mC/EBPα。定點突變參照Fast Mutagenesis System試劑說明書操作。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；然后95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 3 min，28個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.2.3 人肝癌細胞系細胞(HEGP2)的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人肝癌細胞系(HEPG2)用含有濃度為100 U·mL-1青霉素和鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基；在37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)；0.25%胰酶消化液消化；2 d傳代一次；細胞的轉(zhuǎn)染使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑，按照試劑說明書進行操作。

表1 構(gòu)建啟動子突變體所用引物序列

Table 1 Primers used for promoter mutation

引物名稱Primername引物序列(5′?3′)SequencesofprimerL?FABP?F?mC/EBPαCTGAGATTTGTCCGCATGCTCCCAATTGL?FABP?R?mC/EBPαGCGGACAAATCTCAGATTAAAGGAGGAG

1.2.4 轉(zhuǎn)錄因子對雞L-FABP基因啟動子活性影響 HEGP2細胞接種于12孔板中，待細胞生長至70%匯合時，將C/EBPα真核表達載體分別與雞pGL3-L-FABP(-2 076/-20)和突變重組體pGL3-L-FABP-mC/EBPα啟動子報告基因載體共轉(zhuǎn)染HEGP2細胞作為試驗組；pCMV-HA載體分別與雞pGL3-L-FABP(-2 076/-20)和突變重組體pGL3-L-FABP-mC/EBPα啟動子報告基因載體共轉(zhuǎn)染HEGP2細胞作為對照組。海腎熒光素酶報告基因為內(nèi)源參照。每孔細胞轉(zhuǎn)染1 μg質(zhì)粒(表達載體∶啟動子報告基載體質(zhì)量比為3∶2)，0.01 μg的海腎對照質(zhì)粒(PRL-PK)轉(zhuǎn)染48 h，回收細胞，檢測雙報告基因熒光素酶活性。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)均為3次獨立試驗結(jié)果，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析與t檢驗。P<0.05為差異顯著，P<0.01差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1L-FABP啟動子區(qū)域的C/EBPα結(jié)合位點分析

利用Mulan(http：//mulan.dcode.org)和TFSEARCH(http：//www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)網(wǎng)站分析雞L-FABP(-2 076/-20)啟動子序列上轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα結(jié)合位點，設(shè)置Threshold：85.0 point。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在雞L-FABP(-2 076/-20)啟動子序列區(qū)間存在1個C/EBPα結(jié)合位點。結(jié)合在L-FABP翻譯起始位點上游-1 854/-1 841，結(jié)合序列為agatttgtcAAtat。兩個軟件預(yù)測結(jié)果一致。

2.2 定點突變重組體的構(gòu)建與鑒定

以L-FABP基因啟動子(-2 076/-20)質(zhì)粒為模板，利用L-FABP-F-mC/EBPα：5′-CTGAGA-TTTGTCCGCATGCTCCCAATTG-3′，L-FABP-R-mC/EBPα：5′-GCGGACAAATCTCAGATTAA-AGGAGGAG-3′為引物，進行PCR擴增。得到一條約6 874 bp的特異性條帶(圖1)，與預(yù)期的結(jié)果大小一致。菌液提交立菲公司進行測序(圖2)。結(jié)果顯示L-FABP-mC/EBPα啟動子點突變載體構(gòu)建成功。

2.3C/EBPα結(jié)合位點定點突變重組體的啟動子活性分析

M.DNA相對分子質(zhì)量標準；1.原質(zhì)粒為模板點突變PCR產(chǎn)物；2.模板稀釋10倍點突變PCR產(chǎn)物； 3.模板稀釋100倍點突變PCR產(chǎn)物；4.模板稀釋1 000倍點突變PCR產(chǎn)物M.Trans2K Plus П DNA marker(5 μL)；1-4.PCR products of site-directed mutagenesis，plasmid as templates respectively diluted 10，100，1 000 times圖1 C/EBPα結(jié)合位點突變重組體質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of the C/EBPα binding sites mutant

為檢測C/EBPα結(jié)合位點的突變是否影響L-FABP啟動子的活性，將L-FABP啟動子突變體與C/EBPα表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEPG2細胞。48 h后分別檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。結(jié)果表明：1)C/EBPα的外源過表達可以抑制野生型L-FABP的啟動子活性(P=0.028 0)。2)突變L-FABP的啟動子區(qū)C/EBPα結(jié)合位點，C/EBPα外源過表達后L-FABP的啟動子活性增強(P=0.019 2)。3)突變型L-FABP與野生型L-FABP相比突變型L-FABP的啟動子活性高于野生型L-FABP啟動子活性(P=0.003 5)。4)外源過表達C/EBPα，突變型L-FABP啟動子活性高于野生型L-FABP啟動子活性(P=0.002 2)(圖3)。這些結(jié)果說明，C/EBPα結(jié)合位點得到有效突變，也暗示了C/EBPα對L-FABP啟動子活性的抑制效應(yīng)是通過該結(jié)合位點發(fā)揮作用的。

3 討 論

L-FABP基因?qū)毎麅?nèi)脂肪酸的轉(zhuǎn)運、代謝、脂質(zhì)合成及長鏈脂肪酸依賴性基因的調(diào)控具有重要作用[10-11]。筆者前期通過對雞L-FABP多態(tài)性的研究發(fā)現(xiàn)，L-FABP基因可能是影響雞脂肪性狀的重要候選基因[12]。利用生物信息學(xué)軟件對L-FABP的啟動子區(qū)域進行分析，發(fā)現(xiàn)L-FABP的啟動子區(qū)域含有C/EBPα等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點[13]。雞L-FABP基因受到C/EBPα基因負調(diào)控作用，且突變L-FABP啟動子區(qū)C/EBPα結(jié)合位點后失去對L-FABP啟動子的抑制作用。

目前，大量研究證實C/EBPα蛋白對基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是多層次多因子的復(fù)雜精細調(diào)控。其與多種蛋白因子相互協(xié)調(diào)，在脂肪細胞增殖分化、脂肪沉積、胚胎發(fā)育、機體能量代謝、免疫反應(yīng)及多種疾病過程中發(fā)揮重要作用[14-16]。C/EBP基因序列在人和雞之間高度保守[8，17]。在不同物種間C/EBPs家族都是具有重要生物學(xué)作用的功能基因[18-19]。C/EBPα能與Ap2、SCD1、GluT4、leptin等脂肪細胞特征的啟動子位點相結(jié)合并激活其表達，而突變這些基因啟動子區(qū)的C/EBPα結(jié)合位點，則C/EBPα對其無激活效應(yīng)[20]。本研究的結(jié)果顯示，C/EBPα外源過表達可以抑制L-FABP啟動子活性，與筆者前期研究結(jié)果一致[9]。采用定點突變方法將L-FABP啟動子區(qū)域中C/EBPα結(jié)合位點進行突變后，L-FABP的啟動子活性明顯升高。L-FABP突變體啟動子與C/EBPα共轉(zhuǎn)染至人肝癌細胞中，L-FABP突變體啟動子活性顯著增強。通過生物信息學(xué)分析顯示雞L-FABP基因啟動子區(qū)存在多個PPARγ結(jié)合位點。丁寧[21]研究顯示，雞C/EBPα基因表達蛋白能夠結(jié)合于PPARγ基因啟動子區(qū)，并顯著激活其轉(zhuǎn)錄。有報道顯示，adipophilin、L-FABP、RegIA、Gob-4 和NGAL這5個基因是由PPARγ直接調(diào)控的靶基因[22]，此外激活的PPARγ可誘導(dǎo)L-FABP的表達，從而有效地轉(zhuǎn)運脂質(zhì)并促進其代謝[23]。因此推測，這有可能是轉(zhuǎn)染C/EBPα反而造成了L-FABP突變體啟動子區(qū)域其它轉(zhuǎn)錄因子如PPARγ等的結(jié)合量相應(yīng)升高進而促進了L-FABP突變體啟動子活性，但該推測還需進一步研究驗證。

下劃線標示位置為預(yù)測C/EBPα結(jié)合序列，箭頭標示位置為點突變位置，由AAT突變?yōu)镃GCUnderline indicate the predicted C/EBPα sequence，arrow label position for the point mutation，by the AAT mutated into CGC圖2 L-FABP啟動子區(qū)點突變測序結(jié)果Fig.2 The sequencing of L-FABP promoter region site-directed mutagenesis

*表示差顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)*.Means differ significantly(P<0.05)；**.Means highly differ significantly(P<0.01)圖3 定點突變技術(shù)分析雞L-FABP基因啟動子區(qū)C/EBPα結(jié)合位點對該基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響Fig.3 Mutation analysis of the function of C/EBPα binding site in the minimal L-FABP promoter region

L-FABP 是肝中唯一表達的脂肪酸結(jié)合蛋白，介導(dǎo)脂肪酸及多種疏水基團的轉(zhuǎn)運。本研究使用人肝癌細胞系HEPG2作為試驗材料探索L-FABP轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。由于L-FABP基因及轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα在雞和人肝中都有表達且L-FABP、C/EBPα基因氨基酸序列保守性很高，人肝組織中的環(huán)境與禽類肝所提供的環(huán)境相似，因此推測在人和雞的L-FABP基因具有相同的調(diào)控機制，雞L-FABP基因受到C/EBPα基因負調(diào)控作用，并且C/EBPα很可能通過與該位點結(jié)合參與L-FABP的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

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(編輯 郭云雁)

Site Directed Mutagenesis forC/EBPαBinding Sites in ChickenL-FABPPromoter

HE Qi1，2，3，SUN Ying-ning1，2，3，LI Hui1，2，3*，WANG Qi-gui1，2，4*

(1.KeyLaboratoryofChickenGeneticsandBreeding，MinistryofAgriculture，Harbin150030，China； 2.KeyLaboratoryofAnimalGenetics，BreedingandReproduction，EducationDepartmentofHeilongjiangProvince，Harbin150030，China；3.CollegeofAnimalScienceandTechnology，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China；4.ChongqingAcademyofAnimalScience，Chongqing402460，China)

In order to further determine theC/EBPαbinding site ofL-FABPand analyze its role in the regulation ofL-FABPtranscription，theC/EBPαbinding site inL-FABPpromoter was effectively mutated using site-directed mutagenesis in the current study.The results showed that the expression ofL-FABPwas significantly repressed byC/EBPα，but theL-FABPpromoter activity was significantly promoted after the mutation ofC/EBPαbinding site.In a conclusion，the expression ofL-FABPwas significantly repressed byC/EBPα，andC/EBPαprobably involved in the regulation ofL-FABPexpression through this binding site.These results will provide a foundation for further research on the regulatory mechanism and function of chickenC/EBPαonL-FABPgene.

chicken；L-FABPgene；promoter；site-directed mutagenesis；C/EBPαgene

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.003

2014-11-21

國家自然科學(xué)基金(30972087)；博士后研究人員落戶黑龍江科研啟動資助金(LBH-Q08131)；重慶市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)人才培育工程(14401)

賀 綦(1988-)，女，黑龍江哈爾濱人，碩士生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：heqidongke@163.com

*通信作者：李 輝，博士，教授，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail：lihui@neau.edu.cn；王啟貴，博士，教授，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail：wangqigui@hotmail.com

S831.2

A

0366-6964(2015)09-1496-06