不同毛色山羊皮膚組織Agouti基因剪接體類(lèi)型研究

張 天，李祥龍，周榮艷，李蘭會(huì)

(1.河北科技師范學(xué)院，秦皇島066600； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，保定 071000； 3.晉州市職教中心，晉州 052260)

不同毛色山羊皮膚組織Agouti基因剪接體類(lèi)型研究

張 天1，2，3，李祥龍1，2*，周榮艷2，李蘭會(huì)2

(1.河北科技師范學(xué)院，秦皇島066600； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，保定 071000； 3.晉州市職教中心，晉州 052260)

本研究旨在探討白色和黑色山羊皮膚組織Agouti基因所具有的不同剪接體類(lèi)型。采用PCR擴(kuò)增和5′RACE方法分別獲得白色和黑色山羊皮膚組織Agouti基因部分基因組序列及mRNA 序列，并進(jìn)行拼接比對(duì)。結(jié)果，分別獲得了長(zhǎng)度為27 793和27 858 bp的白色和黑色山羊Agouti基因序列，發(fā)現(xiàn)4段序列(88、180、81和79 bp)與綿羊mRNA序列相匹配，這些片段與5′RACE所檢測(cè)到的外顯子1可變剪接體長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)，其中的180、81和79 bp為新發(fā)現(xiàn)片段。白色山羊檢測(cè)到It、It′、IA、2C和IE 5種類(lèi)型剪接體，黑色山羊僅檢測(cè)到It和It′ 2種類(lèi)型剪接體。剪接體之間和剪接體內(nèi)部均存在長(zhǎng)度變異。結(jié)果提示，IA、2C和IE可變剪接可能與山羊毛色形成有關(guān)。

山羊；Agouti基因；皮膚組織；剪接體類(lèi)型

動(dòng)物毛色主要通過(guò)肉眼來(lái)識(shí)別，是鑒定品種外貌的重要標(biāo)志，它在識(shí)別品種純度、親緣關(guān)系，確定雜交組合、評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量等方面有一定優(yōu)勢(shì)，是最能夠引起人類(lèi)關(guān)注的品種特征之一[1-2]。毛色對(duì)于許多動(dòng)物來(lái)說(shuō)是一項(xiàng)重要的生產(chǎn)及可利用的質(zhì)量性狀，是哺乳動(dòng)物中第一個(gè)作為遺傳學(xué)分析的表型性狀[3]。Agouti基因編碼周?chē)谒丶?xì)胞真皮乳頭細(xì)胞分泌的Agouti信號(hào)蛋白(Agouti signal protein，ASIP)，這是一種旁分泌信號(hào)分子[4]，此蛋白與黑素細(xì)胞刺激素α(α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH)競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合黑素皮質(zhì)素受體1(Melanocortin receptor1，MC1R)，控制褐黑色素和真黑色素的生物合成，決定二者的數(shù)量與比例，從而形成不同類(lèi)型的黑色素，產(chǎn)生不同的毛色[5-6]。另外，Agouti基因與其相關(guān)蛋白是糖尿病與腫瘤、肥胖等人類(lèi)疾病的研究熱點(diǎn)之一，Agouti基因位點(diǎn)的全面檢測(cè)將為動(dòng)物品種資源的保存與利用提供重要參考[7]。

控制山羊被毛顏色遺傳的基因座主要有4個(gè)：野生型座位A(稱(chēng)為刺鼠毛色基因座位)、稀釋毛色因子座位D、“上位白”座位I、白斑座位S，4個(gè)基因都位于常染色體上，它們之間不存在連鎖關(guān)系[8-9]。毛色與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)系不大，但與生長(zhǎng)速度、瘦肉率及對(duì)疫病的抵抗力等生產(chǎn)性能有直接關(guān)系，Agouti基因與山羊毛色形成有很大關(guān)系，故Agouti基因?qū)ι窖蛏a(chǎn)性能方面也有影響[10]。山羊Agouti基因已被定位于13q22[11]。哺乳動(dòng)物Agouti基因含有4個(gè)外顯子，外顯子2、3、4編碼131～133個(gè)氨基酸，非翻譯外顯子1存在不同剪接體。動(dòng)物皮膚組織中，Agouti基因非翻譯外顯子1所存在的不同剪接體類(lèi)型可能與該基因的表達(dá)存在某種特定關(guān)系，進(jìn)而影響毛色的變化。

本試驗(yàn)研究探討了白色和黑色山羊皮膚組織Agouti基因5′非翻譯區(qū)外顯子1的剪接體變異類(lèi)型，為探討山羊毛色分子調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 山羊Agouti基因序列的擴(kuò)增

1.1.1 樣品來(lái)源及引物設(shè)計(jì) 使用實(shí)驗(yàn)室-20 ℃冰箱保存的遼寧絨山羊(白色)和雷州山羊(黑色)血液樣品各3個(gè)提取DNA，擴(kuò)增山羊的Agouti基因序列。擴(kuò)增所用引物見(jiàn)表1。

表1Agouti基因5′非翻譯區(qū)PCR擴(kuò)增測(cè)序引物

Table 1 Primers used for amplifying 5′UTR of goatAgoutigene

引物Primer序列(5′→3′)Sequence擴(kuò)增長(zhǎng)度/bpSize退火溫度/℃Annealingtemperature延伸時(shí)間/sExtendingtime循環(huán)數(shù)CycleP1F：TGCTTGATTGGCTGTTCTTCR：TCACTGATGGCAATTCTTCC226160．014535P2F：GGCTGCTTCCATTTGCTGTAR：ACCTGGGTGGTTGGTGATAT267058．016035P3F：TAATGTTTCCCCTAATCCR：TGCTTTCTAAGAGTTTGTCG123856．07535P4F：CTCTTAGGGATAGGCAACACR：CCTCTTCCAAGGGATAGTTC289162．017035P5F：CTGGCTCTTGGTTGCTGTR：TGACTCTGGGTGGAGGTTA293556．917035P6F：GTGAGACTCTTCCTGCCTGTGR：GGTGGCGCAGACAGTAAAG352363．021535P7F：ATCAGCCCTGGGATTTCTTR：GCTTTATCACCCACCCTTCT235860．014535AGT1F：CGGGAGTAATCCAAGAGTCR：TGAGGGAAGAGGAAGCAG39355．06035AGT2F：CATCTGAGACCCAGCATAGCR：CTCACAAACCACCCTACCAT262362．716035AGT3F：AGAACCTGGCTACTATTGCTR：TTGAGAACTGCTGGTGAGAA129558．09035

F代表上游引物，R代表下游引物

The F and R represent forward and reverse primers，respectively

1.1.2 PCR反應(yīng)及產(chǎn)物檢測(cè)與回收 PCR反應(yīng)總體積50 μL：滅菌水32 μL、10×LA PCR Buffer II(Mg2+Plus)5 μL、dNTP Mixture(各2.5 mmol·L-1)8 μL、模板DNA 2.5 μL、P1(20 μmol·L-1)1 μL、P2(20 μmol·L-1)1 μL、TaKaRa LATaq(5 U·μL-1)0.5 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，退火30 s，72 ℃ 延伸(根據(jù)目的片段大小確定延伸時(shí)間)，30～35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 終延伸10 min，4 ℃終止保存。用1.0%～2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收。

1.1.3 回收產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)及陽(yáng)性重組子鑒定 按照pEASY-T3 Cloning Kit說(shuō)明書(shū)將回收的PCR產(chǎn)物通過(guò)TA克隆連接到pEASY-T3載體上，過(guò)夜培養(yǎng)。用滅菌牙簽挑取白色且形狀圓潤(rùn)的單菌落至含有3～5 mL 100 mg·L-1Amp+的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)6～10 h，菌液PCR鑒定重組子。陽(yáng)性克隆送北京中科希林生物科技有限責(zé)任公司測(cè)序。

1.2 山羊Agouti基因5′RACE

1.2.1 RNA提取、純化及反轉(zhuǎn)錄 樣品為12月齡左右的4只白色(B1、B2、B3和B4)和3只黑色(H1、H2和H3)太行山羊皮膚組織。按照TaKaRa RNAiso Plus說(shuō)明書(shū)提取RNA，純化后的RNA用NANODROP 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度及純度。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠150 V，150 mA電泳10 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照并保存，將28S和18S條帶的亮度和寬度比例均為2∶1的RNA按SMARTer 5′RACE cDNA Amplification Kit說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄。RT產(chǎn)物保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 以綿羊mRNA為模板，SMARTer 5′RACE cDNA Amplification Kit中10×Universal Primer A Mix(UPM)和Nested Universal Primer A(NUP，10 μmol·L-1)為上游引物，設(shè)計(jì)下游引物RT1、GSP和NGSP(表2)用作5′RACE試驗(yàn)的引物。

表2 5′RACE所用引物

Table 2 Primers for 5′RACE

引物Primer序列(5′→3′)SequenceRT1GGAGCAGGCGCTGCGGAAGAAGSPGCGGAAGAAGCGGCACTGGCAGAAGGCNGSPTCCTCAGGTGCCAGGTGGCTGT

1.2.3 5′RACE反應(yīng)條件及克隆測(cè)序 按照Advantage 2 PCR Kit說(shuō)明書(shū)分別進(jìn)行Outer PCR和Inner PCR，瓊脂糖檢測(cè)法檢測(cè)PCR產(chǎn)物，高亮條帶的產(chǎn)物均進(jìn)行切膠回收。將回收的Inner PCR產(chǎn)物(B1、B4和H3)通過(guò)TA克隆連接到pMD19-T載體上，Inner PCR產(chǎn)物(B2、B3、H1和H2)通過(guò)TA克隆連接到pEASY-T3載體上，過(guò)夜培養(yǎng)。按上述過(guò)程進(jìn)行陽(yáng)性重組子鑒定和測(cè)序。

2 結(jié) 果

2.1 山羊Agouti基因序列分析

2.1.1 山羊Agouti基因序列擴(kuò)增 引物P1～P7及AGT1～AGT3擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，10對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物的大小與預(yù)期大小一致，均進(jìn)行切膠回收，回收后的產(chǎn)物均進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，菌液PCR檢測(cè)、獲取陽(yáng)性克隆并測(cè)序，切膠回收后電泳結(jié)果如圖1。

2.1.2Agouti基因結(jié)構(gòu)分析 DNAMAN6.0軟件分析后，利用CAP3 Sequence Assembly Program將P1～P7擴(kuò)增獲得的序列進(jìn)行拼接，分別得到長(zhǎng)度為16 161和16 226 bp的白色和黑色山羊拼接序列。將P1～P7拼接獲得的序列再與12 847 bp(JN651404+EF587236)[12]的序列進(jìn)行拼接，分別得到長(zhǎng)度為27 793和27 858 bp的白色和黑色山羊Agouti基因拼接序列。引物AGT1、AGT2、AGT3擴(kuò)增白色山羊獲得的序列長(zhǎng)度分別為364、2 625和1 296 bp；擴(kuò)增黑色山羊獲得的序列長(zhǎng)度分別為367.2622和1 298 bp。

前期所得的長(zhǎng)度為7 357 bp的JN651404包括Agouti基因外顯子1(90 bp)和5′非翻譯區(qū)部分序列(7 267 bp)[13]。利用BioEdit7.0以及Spidey軟件與綿羊mRNA(NM_001134303.1)比對(duì)分析，本試驗(yàn)獲得的白色和黑色山羊Agouti基因序列在外顯子2之前除了88 bp已經(jīng)預(yù)測(cè)外，又發(fā)現(xiàn)3段與綿羊mRNA相匹配序列，長(zhǎng)度分別為180、81和79 bp(表3)。

2.2 山羊Agouti基因的5′RACE擴(kuò)增

2.2.1 山羊Agouti基因反轉(zhuǎn)錄 山羊皮膚組織提取RNA后進(jìn)行純化，純化后的RNA 28S 與18S 泳帶亮度及寬度比例接近 2∶1，且 28S 整齊、清晰，無(wú)嚴(yán)重拖尾，表明 RNA 純度和完整性較好。NANODROP 2000 超微量分光光度計(jì)測(cè)得樣品 A260 nm/A280 nm為 1.8～2.0[14]，說(shuō)明純化后的 RNA 質(zhì)量較高，可以直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

7 只山羊 Outer PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物均無(wú)特異帶，整個(gè)電泳條帶呈現(xiàn)彌散狀(即無(wú)法區(qū)分的抹帶)，故需將 Outer PCR 產(chǎn)物稀釋后進(jìn)行Inner PCR。Inner PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)：白色山羊 B1、B2、B3、B4 分別存在3、4、2、2條帶，黑色山羊 H1、H2、H3 分別存在 3、2、1 條帶，由于擴(kuò)增過(guò)程中可能產(chǎn)生非特異性條帶，故需將各條帶均切膠回收通過(guò)連接、轉(zhuǎn)化，菌液測(cè)序判定目的條帶。切膠純化結(jié)果如圖2所示。

每個(gè)圖中從左到右依次為Marker、白色山羊和黑色山羊的擴(kuò)增條帶From left to right are Marker，amplification products of white and black goats，respectively in each figure圖1 山羊Agouti基因擴(kuò)增Fig.1 Amplifying electrophoresis of goat Agouti gene

表3 白色和黑色山羊5′非翻譯區(qū)分析

Table 3 Analysis results of 5′UTR in white and black goats

山羊毛色Coatcolor擴(kuò)增和拼接序列Sequence位置/bpLocation綿羊mRNA位置/bpLocationofsheepmRNA長(zhǎng)度/bpLength相似性/%Similarity白色山羊WhitegoatAGT1擴(kuò)增364bp152～2321～8181100AGT2擴(kuò)增2625bp1416～149477～15579100433～622154～33318097．822216～22303334～4218897．727793bp拼接序列22606～22774422～59016998．824091～24155591～6556510027617～27787656～82617199．4黑色山羊BlackgoatAGT1擴(kuò)增367bp154～2341～8181100AGT2擴(kuò)增2622bp1411～148977～15579100433～622154～33318098．322281～22368334～4218897．727858bp拼接序列22671～22839422～59016998．824156～24220591～6556510027682～27852656～82617199．4

2.2.2 山羊Agouti基因5′末端序列陽(yáng)性克隆鑒定 山羊Agouti基因5′末端序列PCR擴(kuò)增中出現(xiàn)的條帶分別切膠回收后連接至載體。經(jīng)菌液PCR檢測(cè)B1、B2、B3、H1和H2均出現(xiàn)多種不同大小的片段，B4和H3出現(xiàn)1種片段結(jié)果(圖3)，將檢測(cè)到的大小不同的片段均進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序得到的序列結(jié)果用BioEdit 7.0軟件去除載體并找到上、下游引物，B1、B2、B3、B4、H1、H2和H3分別發(fā)現(xiàn)2、5、3、1、2、2和1種不同長(zhǎng)度的序列可以與Agouti基因比對(duì)上。

各圖中從左到右依次為Marker、Inner PCR切膠回收條帶From left to right are Marker，result of Inner PCR，respectively in each figure圖2 Inner PCR切膠回收Fig.2 Results of Inner PCR

各圖中從左到右依次為Marker、菌液PCR獲得的不同大小片段From left to right are Marker，different fragments by bacterium PCR，respectively in each figure圖3 山羊Agouti基因5′末端序列陽(yáng)性克隆鑒定Fig.3 Clone of Agouti cDNA 5′ termination

2.2.3 山羊5′RACE序列分析

2.2.3.1 白色山羊外顯子1剪接體類(lèi)型：應(yīng)用Spidey軟件將B1、B2、B3和B4測(cè)序結(jié)果與獲得的白色山羊Agouti基因序列比對(duì)分析，結(jié)果列于表4，分析得出4只白色山羊各種剪接體類(lèi)型(圖4)，4只白色山羊中共檢測(cè)到5種不同類(lèi)型剪接體，同一類(lèi)型的剪接體存在不同程度的長(zhǎng)度變異。B1存在It和It′ 2種類(lèi)型的剪接體，It包括兩段，長(zhǎng)度分別為58和81 bp。B2存在It、It′、IA、2C和IE 5種類(lèi)型剪接體，2C在基因組上的位置包含在牛2C(DQ000238.1)剪接體在基因組位置之內(nèi)，說(shuō)明2C剪接體存在于B2中；最長(zhǎng)的It為200 bp，其余It出現(xiàn)不同程度缺失；最長(zhǎng)的It′為80 bp；IA、2C、IE長(zhǎng)度分別為59、85、95 bp。B3存在It、It′和IE 3種類(lèi)型的剪接體，最長(zhǎng)的It為134 bp，其余It 出現(xiàn)不同程度缺失；最長(zhǎng)的It′為80 bp；IE的長(zhǎng)度為95 bp。B4存在It、It′ 2種類(lèi)型的剪接體，長(zhǎng)度分別為83和79 bp。將各個(gè)白色山羊所得的每條序列均用通過(guò)NCBI的Blast在線軟件與山羊基因組序列(AJPT01136617.1)進(jìn)行比較，每條序列與山羊13號(hào)染色體同一區(qū)域序列的相似性均在84% 以上，大多數(shù)相似性為100%，B1、B2、B3、B4 均包括部分Exon2和部分Exon1。綜合4只白色山羊5′RACE結(jié)果得出，4只白色山羊Exon1都能檢測(cè)兩種不同的剪接體類(lèi)型：It、It′，最長(zhǎng)的It為200 bp，其余It序列出現(xiàn)不同程度缺失； It′一種長(zhǎng)度為80 bp，另一種長(zhǎng)度為79 bp。白色山羊B2還檢測(cè)到IA、2C、IE 3種不同的剪接體類(lèi)型，白色山羊B3也檢測(cè)到IE剪接體的存在。

1～364，1～2 625，1～1 295，1～27 793代表Agouti基因序列；B1～B4為白色山羊剪接體類(lèi)型及其在基因組上對(duì)應(yīng)的位置和長(zhǎng)度The 1-364，1-2 625，1-1 295 and 1-27 793 represent Agouti sequences；The B1-B4 represent the location and length of Agouti gene spliceosome in white goat圖4 白色山羊剪接體類(lèi)型Fig.4 Spliceosome types in white goat

2.2.3.2 黑色山羊外顯子1剪接體類(lèi)型：應(yīng)用Spidey軟件將H1、H2和H3測(cè)序結(jié)果與獲得的黑色山羊Agouti基因序列比對(duì)分析，結(jié)果列于表5，分析得出3只黑色山羊不同剪接體類(lèi)型(圖5)，3只黑色山羊中僅檢測(cè)到2種類(lèi)型剪接體，即It和It′，同一種剪接體也存在不同程度的長(zhǎng)度變異。H1存在It、It′ 2 種類(lèi)型的剪接體，最長(zhǎng)的It為134 bp；最長(zhǎng)的It′ 為80 bp。H2 存在It、It′ 2種類(lèi)型的剪接體，最長(zhǎng)的It為160 bp；最長(zhǎng)的It′ 為80 bp； H3只存在It′ 1種類(lèi)型的剪接體，長(zhǎng)度為51 bp。將各個(gè)黑色山羊所得的每條序列均用通過(guò)NCBI的Blast在線軟件與山羊基因組序列(AJPT01136617.1)進(jìn)行比較，每條序列與山羊13號(hào)染色體同一區(qū)域序列的相似性均在99% 以上，H1、H2、H3均包括部分Exon2和部分Exon1。綜合3只黑色山羊5′RACE結(jié)果得出：黑色山羊Exon1檢測(cè)到兩種不同的剪接體類(lèi)型：It和It′，最長(zhǎng)的It為160 bp，其余It序列出現(xiàn)不同程度缺失；It′一種長(zhǎng)度為80 bp，另一種長(zhǎng)度為79 bp。

表4 白色山羊Spidey分析結(jié)果

Table 4 Spidey analysis of white goat B1-B4

山羊Goat擴(kuò)增和拼接序列Sequence位置/bpLocationmRNA位置/bpLocationofmRNA長(zhǎng)度/bpLength相似性/%SimilarityB1結(jié)果1(329bp)27793bp拼接序列22604～22697236～32994100AGT1擴(kuò)增364bp254～311106～16358100AGT2擴(kuò)增2625bp1415～1494158～23780100B1結(jié)果2(277bp)27793bp拼接序列22604～22697184～27794100AGT1擴(kuò)增364bp152～23231～11181100AGT2擴(kuò)增2625bp1416～1494107～18579100B2結(jié)果1(332bp)27793bp拼接序列7189～7282156～2408598．8(得到兩段)22606～22697241～33292100AGT1擴(kuò)增364bp178～23232～8655100AGT2擴(kuò)增2625bp1416～149482～16079100B2結(jié)果2(324bp)27793bp拼接序列22604～22697231～32494100AGT1擴(kuò)增364bp106～23232～15812798．4AGT2擴(kuò)增2625bp1416～1494154～23279100B2結(jié)果3(378bp)27793bp拼接序列22605～22697286～37893100AGT1擴(kuò)增364bp185～31132～15812798．4AGT2擴(kuò)增2625bp1415～1494153～23280100AGT3擴(kuò)增1296bp752～810228～28659100B2結(jié)果4(397bp)27793bp拼接序列22604～22697304～39794100AGT1擴(kuò)增364bp112～31132～23120099．5AGT2擴(kuò)增2625bp1415～1494226～30580100B2結(jié)果5(438bp)27793bp拼接序列22209～22303252～3469597．9(得到兩段)22606～22697347～43892100AGT1擴(kuò)增364bp159～31132～184153100AGT2擴(kuò)增2625bp1415～1494179～25880100B3結(jié)果1(280bp)27793bp拼接序列22604～22697187～28094100AGT1擴(kuò)增364bp150～23232～11483100AGT2擴(kuò)增2625bp1416～1494110～18879100B3結(jié)果2(400bp)27793bp拼接序列22209～22303214～3089598．9(得到兩段)22606～22697309～40092100AGT1擴(kuò)增364bp196～31131～146116100AGT2擴(kuò)增2625bp1415～1494141～22080100B3結(jié)果3(329bp)27793bp拼接序列22604～22697236～32994100AGT1擴(kuò)增364bp178～31130～163134100AGT2擴(kuò)增2625bp1415～1494158～23780100B4結(jié)果1(280bp)27793bp拼接序列22604～22697187～28094100AGT1擴(kuò)增364bp150～23232～11483100AGT2擴(kuò)增2625bp1416～1494110～18879100

表5 黑色山羊H1～H3 Spidey 分析

Table 5 Spidey results of black goat H1-H3

山羊Goat擴(kuò)增和拼接序列Sequence位置/bpLocationmRNA位置/bpLocationofmRNA長(zhǎng)度/bpLength相似性/%SimilarityH1結(jié)果1(333bp)27858bp拼接序列22669～22762240～33394100AGT1擴(kuò)增367bp124～23457～167111100AGT2擴(kuò)增2622bp1411～1489163～24179100H1結(jié)果2(331bp)27858bp拼接序列22669～22762238～33194100AGT1擴(kuò)增367bp180～31332～165134100AGT2擴(kuò)增2622bp1410～1489160～23980100H2結(jié)果1(357bp)27858bp拼接序列22669～22762264～35794100AGT1擴(kuò)增367bp154～31332～191160100AGT2擴(kuò)增2622bp1410～1489186～26580100H2結(jié)果2(280bp)27858bp拼接序列22669～22762187～28094100AGT1擴(kuò)增367bp152～23432～1148398．4AGT2擴(kuò)增2622bp1411～1489110～18879100H3結(jié)果1(173bp)27858bp拼接序列22669～2276280～17394100AGT2擴(kuò)增2622bp1439～148931～8151100

1～367、1～2622、1～1298、1～27858代表Agouti基因序列；H1～H3部分為黑色山羊剪接體類(lèi)型及其在基因組上對(duì)應(yīng)的位置和長(zhǎng)度The 1-367，1-2622，1-1298 and 1-27858 represent Agouti；The H1-H3 represent the location and length of Agouti gene spliceosome in black goat圖5 黑色山羊剪接體類(lèi)型Fig.5 Spliceosome types in black goat

3 討 論

3.1 山羊Agouti基因5′非翻譯區(qū)序列變異

山羊Agouti基因5′非翻譯區(qū)外顯子1存在不同類(lèi)型剪接體，之前獲得的12 847 bp(JN651404+EF587236)基因組序列不足以檢測(cè)到更多的剪接體類(lèi)型。研究發(fā)現(xiàn)，綿羊的白色是由于Agouti基因附近190 kb(包括AHCY基因和ICTH基因啟動(dòng)子)順接重復(fù)引起的[15]，而綿羊CH243-455O4 這條較長(zhǎng)的序列跨越了兩個(gè)重復(fù)，CH243-455O4 反向互補(bǔ)序列與12 847 bp這段序列相似性很高，故以綿羊CH243-455O4 反向互補(bǔ)序列為模板擴(kuò)增12 847 bp 之前部分序列。另外，將綿羊CH243-455O4 反向互補(bǔ)序列與綿羊ItIt′IA(EU420026.1)、ItIt′(EU420024.1)比對(duì)，CH243-455O4的反向互補(bǔ)序列中包括53 571～53 651、57 572～57 650、64 870～64 928 bp的3段序列預(yù)測(cè)為外顯子1的不同剪接體類(lèi)型，故也擴(kuò)增了CH243-455O4反向互補(bǔ)序列中包括該3段的序列。

獲得的基因組序列與綿羊mRNA序列比對(duì)分析后，分別得到長(zhǎng)度為88、180、81和79 bp的山羊Agouti基因5′非翻譯區(qū)序列，推測(cè)山羊Agouti基因5′非翻譯區(qū)可能包含4個(gè)或更多不同長(zhǎng)度的非編碼外顯子，而5′ RACE所檢測(cè)到的外顯子1可變剪接體基本與此對(duì)應(yīng)。

3.2 山羊外顯子1剪接體變異

菌液測(cè)序得出的所有序列結(jié)果首先進(jìn)行Blast分析，將非特異性擴(kuò)增的序列去除，各個(gè)測(cè)序結(jié)果均與山羊基因組的相似性在98% 以上，只是結(jié)合的位置與長(zhǎng)短略有差別，此部分結(jié)果與牛、綿羊中的報(bào)道一致[16-17]。對(duì)白、黑、棕色羊駝Agouti基因進(jìn)行5′RACE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了3種不同長(zhǎng)度的5′非翻譯區(qū)序列，分別為136、142、196 bp；長(zhǎng)度為196 bp的5′ 非翻譯區(qū)序列與牛外顯子1C的相似性高達(dá)85%[17]。本研究中白色山羊(B1、B2、B3)，黑色山羊(H1、H2)分別獲得2種或者大于2種5′ 非翻譯區(qū)序列，其長(zhǎng)度均不相同，與羊駝研究結(jié)果類(lèi)似。5′RACE結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白色山羊B2 存在5種類(lèi)型剪接體，分別是It、It′、IA、2C、IE，白色山羊均存在It、It′ 2種類(lèi)型，B3也檢測(cè)到IE 剪接體的存在，每只山羊得出的剪接體的類(lèi)型與數(shù)目不同，這與山羊個(gè)體本身也有關(guān)；黑色山羊H1、H2存在2種類(lèi)型剪接體：It、It′，黑色山羊H3只存在一段很短的It′，可能與H3 RNA提取的完整性較差相關(guān)，或者H3本身就只有一種類(lèi)型的剪接體。分析得出：白色、黑色山羊Agouti基因外顯子1剪接體類(lèi)型不同，不同的剪接形式可能產(chǎn)生不同毛色，IA、2C、IE可變剪接形式只在白色山羊中發(fā)現(xiàn)，推測(cè)：IA、2C、IE可變剪接體可能與山羊白色形成有關(guān)。黑色、白色山羊It、It′ 均存在不同程度的缺失，推測(cè)：可能是在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中由于使用的是特異性引物，包含It、It′ 的兩段序列反轉(zhuǎn)錄后得到較多長(zhǎng)度不同的片段，后續(xù)，需將5′RACE試驗(yàn)結(jié)果通過(guò)RT-PCR或qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步證實(shí)此部分結(jié)果的可靠性。根據(jù)白色、黑色山羊It、It′ 以及白色山羊IA在基因組上所處的位置推測(cè)：5′ RACE 所檢測(cè)的4只白色山羊和3只黑色山羊均存在拷貝變異，而綿羊的白色是由于Agouti基因附近190 kb順接重復(fù)的啟動(dòng)子引起位于下游的Agouti基因表達(dá)從而表現(xiàn)白色，黑色綿羊Agouti基因不表達(dá)，山羊所得結(jié)果與綿羊有差異，后續(xù)可以通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證從而進(jìn)一步確定拷貝是否確實(shí)存在。

4 結(jié) 論

4.1 擴(kuò)增獲得的基因序列與12 847 bp(JN651404+EF587236)序列拼接獲得了長(zhǎng)度分別為27 793和27 858 bp白色和黑色山羊Agouti基因序列。擴(kuò)增獲得CH243-455O4的反向互補(bǔ)序列中包括53 571～53 651、57 572～57 650和64 870～64 928 bp 3段序列，白色山羊獲得的包含此3段序列長(zhǎng)度分別為364、2 625和1 296 bp；黑色山羊獲得的包含此3段序列的長(zhǎng)度分別為367、2 622和1 298 bp。

4.2 獲得了與綿羊mRNA序列相匹配的長(zhǎng)度分別為88、180、81和79 bp的山羊Agouti基因5′非翻譯區(qū)序列，其中的180、81和79 bp為新發(fā)現(xiàn)片段，推測(cè)山羊Agouti基因5′非翻譯區(qū)可能包含4個(gè)或更多不同長(zhǎng)度的非編碼外顯子，與5′RACE所檢測(cè)到的外顯子1可變剪接體長(zhǎng)度有所對(duì)應(yīng)。

4.3 白色山羊中檢測(cè)到5種類(lèi)型的外顯子1剪接體，即It、It′、IA、2C和IE，黑色山羊僅檢測(cè)到It和It′ 2種可變剪接體。剪接體之間和剪接體內(nèi)部均存在長(zhǎng)度變異。IA、2C和IE可變剪接體可能與山羊毛色形成有關(guān)。

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(編輯 郭云雁)

Study onAgoutiSpliceosome Types in Goat Skin with Different Coat Color

ZHANG Tian1，2，3，LI Xiang-long1，2*，ZHOU Rong-yan2，LI Lan-hui2

(1.HebeiNormalUniversityofScience&Technology，Qinhuangdao066600，China；2.AgriculturalUniversityofHebei，Baoding071000，China；3.JinzhouVocationalEducationCenter，Jinzhou052260，China)

The objective of this study was to investigate the variant types of goatAgoutigene spliceosome in goat skin with different coat color.The sequences and mRNA of goatAgoutigene were obtained and analyzed from goat skin with different coat color by PCR and 5′RACE methods，respectively.The 27 793 and 27 858 bp of partialAgoutigene sequences were obtained from white and black goat skin，respectively.Four fragments，88，180，81 and 79 bp，in which the 180，81 and 79 bp were first detected in goat，were matched with the sequences of sheep mRNA and corresponded with the length of exon 1 spliceosome obtained by 5′RACE.The 5 types(It，It′，IA，2C and IE) of spliceosome were detected in goat skin with white coat color，and only 2 types(It and It′) were found in goat skin with black coat color.There was length variation within and among spliceosomes.The result indicate that the IA，2C and IE might be related with the formation of goat coat color.

goat；Agoutigene；skin tissue；spliceosome types

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.11.004

2014-12-31

國(guó)家自然科學(xué)基金(31172196)；河北省高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)領(lǐng)軍人才培育計(jì)劃(LJRC004)；河北省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃重點(diǎn)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(15962901D)

張 天(1987-)，女，河北藁城人，碩士，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究，E-mail：zhangtian19870417@163.com

*通信作者：李祥龍，博士，教授，博導(dǎo)，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究，E-mail：Lixianglongcn@yahoo.com

S827；S813.3

A

0366-6964(2015)11-1934-10