益眠達(dá)片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

汪 濤，胡衛(wèi)東，高永喜，李衛(wèi)興，曾凡波

（1.中國(guó)人民解放軍武漢療養(yǎng)院，湖北 武漢 430074； 2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，湖北 武漢 430030）

益眠達(dá)片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

汪 濤1，胡衛(wèi)東1，高永喜1，李衛(wèi)興1，曾凡波2

（1.中國(guó)人民解放軍武漢療養(yǎng)院，湖北 武漢 430074； 2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，湖北 武漢 430030）

目的 建立益眠達(dá)片的質(zhì)量控制方法。方法 用薄層色譜（TLC）法對(duì)首烏藤、合歡皮進(jìn)行定性鑒別；用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定益眠達(dá)片中五味子所含五味子醇甲的量，色譜柱為Shiseido Capcell Pak C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇－水（55∶45），檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm。結(jié)果 TLC檢出了首烏藤、合歡皮特征斑點(diǎn)；五味子醇甲進(jìn)樣量在0.118 9～1.189 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系（r＝0.999 9），加樣回收率為98.55%，RSD為1.47%（n＝6）。結(jié)論 所建立的質(zhì)量控制方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可靠，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。

益眠達(dá)片；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；高效液相色譜法；薄層色譜法

益眠達(dá)片為中國(guó)人民解放軍武漢療養(yǎng)院研制開發(fā)的純中藥制劑，于2011年取得軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑臨床研究批準(zhǔn)文號(hào)（廣L2011002），具有益氣生津、安神補(bǔ)腦、鎮(zhèn)靜安眠的作用，用于治療失眠、多夢(mèng)、胸脅脹滿、郁悶不舒、心煩心悸、頭痛健忘、神經(jīng)衰弱、抑郁、焦慮等癥。為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，對(duì)首烏藤和合歡皮進(jìn)行了薄層色譜（TLC）鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)方中五味子中的活性成分五味子醇甲進(jìn)行了含量測(cè)定，為該制劑建立完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀，包括HP－1110四元泵，HP－1110 DAD檢測(cè)器，HP Chemstation化學(xué)工作站（Agilent公司）；電子天平（CP225D，1／10萬）；KQ－500B型超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）。硅膠H薄層板、硅膠G薄層板均由青島海洋化工廠分廠提供。五味子醇甲對(duì)照品（供含量測(cè)定用，批號(hào)為110857－200405）、大黃素對(duì)照品均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；益眠達(dá)片（批號(hào)分別為 130513，130407，130314，由中國(guó)人民解放軍武漢療養(yǎng)院提供）。甲醇為色譜純（Lanscanltd），水為純水機(jī)凈化水（純水機(jī)型號(hào)Millipore Milli－Qbiocel），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

首烏藤：取本品10片，研細(xì)，加乙醇50 mL，超聲處理30 min，加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。取大黃素對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取缺首烏藤的模擬片20片，按供試品溶液制備法制備陰性對(duì)照品溶液。照TLC法［1］試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H板上，以石油醚（30～60℃）－甲酸乙酯－甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)（見圖1）；置氨蒸氣中熏后，斑點(diǎn)變?yōu)榧t色。

合歡皮：取本品10片，研細(xì)，加50%甲醇30 mL，浸泡1 h，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇5 mL使溶解，用正丁醇振搖提取2次，每次5 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状?.5 mL使溶解，作為供試品溶液。取合歡皮對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照品溶液。另取缺合歡皮的模擬片20片，按供試品溶液制備法制備陰性對(duì)照品溶液。照TLC法［1］試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－甲酸（13∶5∶2）的下層溶液（每10 mL加甲酸0.1 mL）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%磷鉬酸乙醇試液，在90℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)［2］，見圖2。

圖1 首烏藤薄層色譜圖

圖2 合歡皮薄層色譜圖

2.2 五味子醇甲含量測(cè)定［3－7］

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Shiseido Capcell Pak C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇－水（55∶45）；流速：1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；柱溫：40℃［3］。分離度（R）大于1.5，理論板數(shù)按五味子醇甲峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2.2 溶液制備

精密稱取五味子醇甲對(duì)照品15 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻；精密量取2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液（每1 mL中含五味子醇甲60 μg）。取本品20片，研細(xì)，置分液漏斗中，用乙醚提取4次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按樣品處方制備缺五味子的模擬樣品，精密量取10 mL，按擬訂方法制備陰性對(duì)照品溶液。將上述3種溶液分別注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，得色譜圖（見圖3）?？梢?，供試品溶液與對(duì)照品溶液在相應(yīng)位置上有相似峰，而陰性對(duì)照品溶液則無此峰出現(xiàn)。

2.2.3 方法學(xué)考察

圖3 高效液相色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：精密稱取五味子醇甲對(duì)照品14.86mg，置50mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得59.44 μg／mL五味子醇甲對(duì)照品溶液，分別吸取2，4，6，10，20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，以五味子醇甲對(duì)照品溶液進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)、峰面積值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［3］，得回歸方程 Y＝1.976×106X＋6.830×103，r＝0.999 9（n＝5）。結(jié)果表明，五味子醇甲進(jìn)樣量在0.118 9～1.189 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密量取同一對(duì)照品溶液10 μL和供試品（批號(hào)為130513）溶液各10 μL，按擬訂色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果五味子醇甲色譜峰平均峰面積為1134196，RSD為0.47%（n＝6），供試品色譜峰平均峰面積為1 452 514，RSD為0.31%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品（批號(hào)為130513）溶液10 μL，分別于配制后0，1，4，8，15，24 h的依法測(cè)定。結(jié)果的 RSD為1.63%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號(hào)為130513）溶液6份，精密量取10 mL，分別依法制備供試品溶液，并進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算得五味子醇甲的平均含量為0.064 g／L，RSD為1.27%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)［7］：精密量取已知含量的同一批樣品（批號(hào)為130513，含量為0.063 52 g／L）5 mL，精密加水5 mL，混勻，再精密加入五味子醇甲對(duì)照品（0.273 0 g／L）乙醚溶液20 mL，振搖提取，分取乙醚層，水層溶液繼續(xù)用乙醚振搖提取3次，每次20 mL，合并4次乙醚提取液，蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定含量并計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 五味子醇甲加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

分別精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，采用外標(biāo)法計(jì)算五味子醇甲的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果批號(hào)為 130513，130407，130314的3批樣品中五味子醇甲含量分別為每片 0.063，0.055，0.057 mg，平均含量為每片0.058 mg。

3 討論

益眠達(dá)片由合歡皮、首烏藤、生地、熟地、五味子等藥組方。合歡皮甘平，入心、肝、脾經(jīng)，有解郁安神之功，《神農(nóng)本草》謂合歡有“安五臟，和心志，令人歡樂無憂”之說，其所含皂苷、鞣質(zhì)等有鎮(zhèn)靜作用，用于憤怒、憂郁所致失眠、虛煩不安。首烏藤甘、苦、澀，微溫，入肝、腎經(jīng)，有補(bǔ)肝腎、益精血、養(yǎng)心安神、養(yǎng)血通絡(luò)的作用，用于陰虛血少之須發(fā)早白、眩暈?zāi)垦?、腰膝酸軟乏力者，常與熟地黃同用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，首烏藤和根莖含蒽醌類，主要為大黃酚、大黃素、大黃素甲醚等蒽醌類化合物，主要用于心神不寧、失眠多夢(mèng)［8］。生地甘、微苦、寒，入心、肝、腎經(jīng)，寒性較大，汁液較豐，長(zhǎng)于清熱涼血生津、滋陰補(bǔ)腎。熟地甘、微溫，入心、肝、腎經(jīng)，滋陰補(bǔ)血，治陰虛血少、腰膝痿弱［9］。五味子具有潤(rùn)肺、止汗、滋腎、澀精的功效，能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力，抑制機(jī)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)［10］。諸藥合用，共奏滋陰養(yǎng)血、清熱解郁，寧心安神之功效。

按本品處方比例及制備工藝分別制備不含首烏藤、合歡皮的缺味樣品并制成陰性對(duì)照品溶液，分別與相應(yīng)的供試品同板進(jìn)行薄層色譜試驗(yàn)。結(jié)果，各陰性對(duì)照均無相應(yīng)斑點(diǎn)，該2味藥的鑒別方法具有專屬性。

本研究中，采用TLC法對(duì)益眠達(dá)片中首烏藤、合歡皮2味藥材進(jìn)行鑒別，并采用HPLC法對(duì)方中五味子中的活性成分五味子醇甲進(jìn)行含量測(cè)定，方法簡(jiǎn)便，專屬性和重復(fù)性好，且結(jié)果穩(wěn)定，可用于益眠達(dá)片的質(zhì)量控制。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄ⅥB 34.

［2］何遠(yuǎn)樓.清熱祛濕顆粒的薄層色譜鑒別［J］.中國(guó)藥業(yè)，2012，21（4）：49－50.

［3］古海鋒，劉 然，張小茜，等.安神健腦液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2010，17（2）：50－52.

［4］唐曉蓉，余敏靈.反相高效液相色譜梯度洗脫法測(cè)定安神補(bǔ)心片中丹參酮ⅡA和丹酚酸B含量［J］.中國(guó)藥業(yè)，2012，21（4）：46－47.

［5］華 彬，毛春芹，陸兔林.莪術(shù)飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中國(guó)藥業(yè)，2012，21（4）：28－30.

［6］黃丹瑩，李惠敏.抗骨增生片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究［J］.中成藥，2010，32（6）：1 073－1 076.

［7］陳學(xué)松，劉慧妍.陽春片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2010，27（3）：263－265.

［8］翟學(xué)佳，劉金梅，史 芳，等.健腦合劑的質(zhì)量控制方法研究［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，31（4）：483－485.

［9］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：2 626.

［10］張秀恩.64例參芪五味子治療失眠患者的臨床療效分析［J］.北方藥學(xué)，2012，9（1）：53－54.

R284.1；R286.0

A

1006－4931（2015）02－0046－02

汪濤（1978－），男，主管藥師，研究方向?yàn)獒t(yī)院藥學(xué)，（電話）027－83814769（電子信箱）taidi1127＠126.com。

2013－12－08；

2014－06－15）