垂盆草顆粒中槲皮素、山奈素與異鼠李素的HPLC測定方法研究

汪正宇

(宿州市食品藥品檢驗所，安徽宿州 234000)

垂盆草(Sedum sarmentosum Bunge)為景天科植物，全草入藥，清熱解毒，治癰腫、帶狀皰疹、毒蛇咬傷、燙傷、燒傷，也是治療肝炎的有效藥物。化學(xué)成分研究表明，從垂盆草中分離并鑒定的化合物主要有黃酮及其苷、三萜、甾醇、生物堿、氰苷、氨基酸、糖類等。垂盆草顆粒是由垂盆草的新鮮全草經(jīng)提取、制粒制備而成的中成藥，具有清利濕熱、降低谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的作用，用于清熱解毒，活血利濕，急慢性肝炎濕熱瘀結(jié)證［1－2]。為全面控制藥品質(zhì)量，我們結(jié)合參考文獻［3－7]，對垂盆草顆粒中黃酮類化合物中的化學(xué)成分進行了研究，建立槲皮素、山奈素和異鼠李素建立含量測定方法，考察該藥活性成分，以便控制藥品質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 DIONEX UltiMate 3000系列(SRD-3400A分析泵、WPS-3000自動進樣器、TCC-3000SD柱溫箱、VDW-3000檢測器);工作站:Chromeleon?Dionex 版本 7．1．2．1478;色譜柱:SunFire-ODS C18(150 mm ×4．6 mm，5 μm);KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗器(江蘇省昆山超聲儀器有限公司);梅特勒AB-135S型電子天平(D=0．01 mg)。

1．2 試藥 垂盆草顆粒(批號:120914、130115、130701，上海海虹實業(yè)(集團)巢湖今辰藥業(yè)有限公司);槲皮素對照品(批號:100081-20907，97．4%)，山奈素對照品(批號:110861-201209)，異鼠李素(批號:110860-201109)，對照品均來自中國藥品生物制品檢定院;甲醇(色譜純，美國Tedia公司);水(自制純化水)。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件 流動相:以甲醇—0．4%磷酸溶液(50∶40);流速:1．0 mL·min－1，檢測波長:360 nm，柱溫:25℃，進樣量:10μL。

2．2 對照品溶液的制備 取槲皮素對照品、山奈素對照品、異鼠李素對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL各含15、5、5μg的混合溶液，即得。

2．3 供試品溶液的制備 精密稱取垂盆草顆粒2．006 5g，加入甲醇—25%鹽酸溶液(4∶1)混合溶液25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇—25%鹽酸溶液(4∶1)混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2．4 陰性供試品溶液的制備 取缺槲皮素、山奈素和異鼠李素的陰性樣品，按2．3項下制得缺車前子陰性供試品溶液。

2．5 陰性干擾試驗 分別取對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各10μL，依上述色譜條件測定，結(jié)果顯示陰性無干擾，見圖1。

2．6 線性關(guān)系的考察 精密量取2．2項下的對照品溶液 2，5，10，15，20，25 μL，注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖，以對照品進樣量為橫坐標(biāo)(X)、峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，求得回歸方程:槲皮素Y=4 025．4X － 18 414，r2=0．999 8，山奈素 Y=4 157．6 X － 12 749，r2=0．999 9，異鼠李素 Y=3 908．2X － 16 478，r2=0．999 9。結(jié)果表明，槲皮素、山奈素和異鼠李素的進樣量分別在34．35～429．43、10．83 ～135．37、12．39 ～154．94 μg 范圍內(nèi)與峰面積分值呈良好的線性關(guān)系。

2．7 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10 h進樣，取 10 μL注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定。結(jié)果槲皮素、山奈素和異鼠李素峰面積的RSD分別為0．8%、1．8%和1．9%(n=5)，表明供試品10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．8 精密度試驗 取混合對照品溶液10μL，連續(xù)進樣6次，按上述色譜條件測定峰面積。結(jié)果槲皮素、山奈素和異鼠李素峰面積的RSD分別為1．5%、0．6%和0．6%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2．9 加樣回收率試驗 取已知含量的垂盆草顆粒(批號130115)6份，各加入一定量的槲皮素、山奈素和異鼠李素對照品，稀釋成相應(yīng)濃度的對照品溶液，搖勻并過濾，取10μL進入色譜儀，記錄色譜圖，并計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 山奈素、槲皮素和異鼠李素回收率測定結(jié)果(n=6)

2．10 樣品測定 取3批垂盆草顆粒，按2．3項下制備供試品溶液，依法測定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算3批樣品含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品的測定結(jié)果(n=3)/mg·g－1

3 討論

本實驗所采用的液相色譜條件初始參考《中國藥典》一部中垂盆草藥材［8]項下方法，利用流動相甲醇—0．4%磷酸溶液(45∶55)進行試驗，發(fā)現(xiàn)保留時間較長，各峰之間分離度較好;筆者提高流動相中有機成分比例，結(jié)果分離度較好，運行時間也大大減少，所以最終確定流動相為甲醇—0．4%磷酸溶液(50∶40)。在選擇樣品提取方法時，筆者先后采用超聲、萃取和回流法分別進行試驗，通過對比試驗結(jié)果，可以得出回流方法重復(fù)性高，提取相對完全，所以本文采取回流法提取樣品［9]。

垂盆草中含有垂盆草苷、黃酮類、甾醇類和三萜類、有機酸、氨基酸等化合物，其中具有保肝降酶作用的活性成分主要為黃酮類和垂盆草苷類。而槲皮素、山奈素和異鼠李素是黃酮類主要化學(xué)成分，槲皮素具有抗癌、抗炎、抗菌、抗氧化、保護心血管系統(tǒng)和保護皮膚等作用，山奈素對酪氨酸酶TYR活性有抑制作用。所以研究上述三種成分檢測方法，對于控制垂盆草顆粒質(zhì)量，發(fā)揮積極治療作用有著重要作用［10－11]。

本研究建立了垂盆草顆粒中槲皮素、山奈素及異鼠李素含量測定方法，經(jīng)方法學(xué)考察，均符合中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，該方法簡便、準(zhǔn)確、可控，重復(fù)性高，可作為控制垂盆草質(zhì)量的指標(biāo)。

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