小籃子法測定植物種子呼吸速率的方法改進

李海霞， 徐久瑋， 蔡明歷， 曾漢來， 王學奎

(華中農業(yè)大學 植物科學技術學院 作物學國家級實驗教學示范中心， 武漢 430070)

小籃子法測定植物種子呼吸速率的方法改進

李海霞， 徐久瑋， 蔡明歷， 曾漢來， 王學奎

(華中農業(yè)大學 植物科學技術學院 作物學國家級實驗教學示范中心， 武漢 430070)

利用CO2紅外氣體分析儀對測定植物種子CO2呼吸速率的小籃子法進行了改進。結果表明：改良小籃子法操作簡便，可實時監(jiān)測數(shù)據(jù)變化，測定的實驗數(shù)據(jù)準確度較高,變異系數(shù)較小，在一定程度上克服了傳統(tǒng)小籃子法的缺陷，使實驗測定更具科學性和嚴謹性，可用于本科生植物生理學實驗教學。

呼吸速率；小籃子法；方法改進；實驗教學

在華中農業(yè)大學本科生的《植物生理學實驗》課程中開設了利用小籃子法(又稱廣口瓶法、堿吸收法、堿中和法、化學滴定法)對植物種子呼吸速率進行測定的實驗內容。

測定種子呼吸速率的方法有多種，其中常用的有微量定容測壓法[1-2]和小籃子法[3-9]。微量定容測壓法測定種子呼吸速率的原理是在恒溫和恒體積的條件下，用壓力變化測定O2的消耗量，一般利用的儀器是微量呼吸檢壓計[10]。但此法的缺點是所用樣品體積小, 取樣要求精細, 過程較繁瑣，若操作技術欠熟練, 誤差較大。小籃子法測定種子呼吸速率的原理是用堿液吸收在單位時間內呼吸產(chǎn)生的CO2，再利用酸堿中和滴定原理滴定剩余的堿液，由空白和樣品二者消耗的酸溶液之差即可計算出呼吸過程中釋放的CO2的量[10]。由于只需要簡單裝置，因而小籃子法適用性較廣，但其缺點是在實驗操作過程中難以避免會有外界CO2的侵入和干擾，人為和客觀影響因素較多，致使測定結果精確度較差。

隨著中國科學技術的進步，現(xiàn)已開發(fā)出價格適中、適合教學的IRGA。為克服傳統(tǒng)小籃子法測定植物種子呼吸速率的缺陷，本實驗利用IRGA對其進行改進，進一步提高實驗測定的科學性和嚴謹性，以期利用先進儀器設備提升本科生植物生理學實驗教學水平。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本實驗選取適量油菜、小麥和玉米種子用清水分別浸種12 h、24 h和24 h(中間換水1次)，將浸泡好的種子平鋪在瓷盤中，用濕毛巾覆蓋催芽，以剛露芽為宜。

1.2 實驗方法

1.2.1 傳統(tǒng)小籃子法測定種子呼吸速率

參照王學奎[10]的方法，設計2.5 g、5.0 g和10.0 g 3個不同種子用量的處理，反應時間分別為10 min、20 min和30 min，每個處理重復3～5次。

狀態(tài)3 在iP(t)反向的時刻(即等效電流源iP(t)在零點的時刻),電路進入狀態(tài)3。壓電電容CP上充滿了電,此時同步開關閉合,并聯(lián)電感L和壓電電容CP形成L-C振蕩回路,將電容上的電壓在這一時刻進行反向,待L-C振蕩結束后,CP上的電壓完成反向,同步開關及時斷開。至此,狀態(tài)3結束。

式中，Vo為空白滴定用去的草酸量(mL)，Vs為樣品滴定用去的草酸量(mL)，W為樣品鮮質量(g)，t為測定時間(h)，1為每毫升1/44 mol/L的草酸相當于1 mg CO2，44為CO2的相對分子量(g/mol)。

1.2.2 改良小籃子法測定種子呼吸速率

設計2.5 g、5.0 g和10.0 g 3個不同種子用量以及2 min、4 min、6 min、8 min和10 min 5個不同反應時間的處理，對于10.0 g種子用量的處理再增加15 min和20 min 2個反應時間。每個處理重復3～5次。利用CB-1101光合蒸騰作用測定系統(tǒng)(北京雅欣理儀科技有限公司)檢測種子呼吸產(chǎn)生的CO2量的變化，采取閉路測量方式進行測定：將流量計與儀器面板上的“IN1”和“OUT1”接氣嘴相連，堿石灰管與“IN”和“OUT”接氣嘴相連，調節(jié)流量計流速為0.6 L/min，進行CO2分析器調零；完成調零后取下堿石灰管，用一根硅膠管將“IN”和“OUT”接氣嘴相連，封閉此段氣路。把稱重后的測試材料放入一個500 mL廣口瓶內，瓶口用打有兩孔的橡皮塞塞緊，用硅膠管與儀器的“IN2”和“OUT2”接氣嘴相連，先平衡2 min，再開始測量：先按“參/初”鍵，再按“測/終”鍵，記下CO2初始濃度值(μL/L)，到了測定時間(面板上有計時器)，記下CO2最終濃度值(μL/L)，測量結束時按下“完成”鍵，再重復上述步驟即可開始下一次測量。在開始測量之前，先向各接口處吹氣來檢查是否漏氣，以保證氣路的密封性良好。

式中，V為反應體積(L)，ΔC為CO2濃度差值(μL/L，為CO2最終濃度值與初始濃度值的差值)，W為樣品鮮質量(g)，t為測定時間(h)，24.5為25℃時標準大氣壓下的氣體摩爾體積(L/mol)。

1.2.3 溫度控制

將裝有材料的廣口瓶放在水浴鍋中保溫，以維持瓶內反應溫度為25℃。

1.2.4 統(tǒng)計分析

用Excel2003進行數(shù)據(jù)處理，并用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件進行顯著性差異分析。

2 結果與討論

本實驗采用傳統(tǒng)和改良小籃子法測定油菜、小麥和玉米3種作物萌發(fā)種子的CO2呼吸速率，使用3個不同種子用量，每種處理各重復3～5次。傳統(tǒng)小籃子法測定的結果見表1，改良小籃子法測定的結果見表2、表3。

表1 傳統(tǒng)小籃子法測定萌發(fā)種子的CO2呼吸速率

**—顯著性差異(P<0.01)。

由表1可看出，同一種作物不同種子用量的呼吸速率差異較大，且呼吸速率隨種子用量的增加而降低，3種作物的表現(xiàn)趨勢一致。統(tǒng)計分析表明傳統(tǒng)小籃子法的同種作物不同種子用量間的呼吸速率差異達到極顯著水平、變異系數(shù)也較大，實驗結果精密度差、測定值偏高。

在改良小籃子法中，連好氣路后先平衡2 min，之后再隔2 min、4 min、6 min、8 min和10 min各測定1次，對于10.0 g種子用量的在15 min和20 min時再各測定1次。結果表明(表2)：同一作物不同反應時間、不同種子用量間的ΔC比較穩(wěn)定且隨種子用量的增加而增大(資料未顯示)，呼吸速率比較穩(wěn)定。同種作物不同反應時間的呼吸速率差異不顯著，小麥和玉米的2.5 g與5.0 g、10.0 g這2個種子用量間的呼吸速率差異達到顯著水平，而油菜不同種子用量間的呼吸速率無顯著性差異。在10.0 g種子用量的測定中(表3)，除玉米外，油菜和小麥的呼吸速率在反應時間超過10 min后都隨時間延長而呈現(xiàn)下降趨勢，且反應時間為15 min和20 min的呼吸速率與其它反應時間的差異達到顯著水平。這是因為廣口瓶內氧氣量有限，隨著呼吸作用的進行，氧氣量越來越少，導致不能滿足種子呼吸作用的需要。呼吸速率越小，氧氣可供應的時間就越長(如玉米)。此外，改良小籃子法測定的呼吸速率的變異系數(shù)較小，實驗結果更真實可靠。

表2 改良小籃子法測定萌發(fā)種子的CO2呼吸速率

*—小麥和玉米的2.5 g與5.0 g、10.0 g這兩個種子用量間的呼吸速率具有顯著性差異(P<0.05)。

表3 改良小籃子法測定10.0 g萌發(fā)種子的CO2呼吸速率

*—顯著性差異(P<0.05)；**—顯著性差異(P<0.01)。

通過分析操作步驟及實驗原理，對造成這兩種方法實驗結果差異的影響因素進行比較(表4)。由此可見，傳統(tǒng)小籃子法中Vo和Vs只有一個終點值，而沒有中間值，不能實時監(jiān)測化學反應的進行情況，也不能根據(jù)測試材料的呼吸速率特性判斷適宜的反應時間。傳統(tǒng)小籃子法易造成誤差的影響因素比改良小籃子法多，即便是規(guī)范操作，也難以避免會有外界CO2的侵入和干擾，且種子用量越少，受影響的程度越高。而改良小籃子法則在一定程度上克服了傳統(tǒng)方法的缺陷，可實時監(jiān)測ΔC數(shù)據(jù)變化，便于確定測試材料的最佳測定時間，且在一定時間內(10 min)測定呼吸速率都較穩(wěn)定，使實驗測定更緊密、實驗數(shù)據(jù)更可靠。

表4 兩種測定方法實驗結果差異的影響因素比較

3 結論

本實驗對測定植物種子CO2呼吸速率的傳統(tǒng)小籃子法進行了改進，改良小籃子法的實驗結果更準確可靠。采用改良小籃子法(500 mL體積)測定種子呼吸速率的最適種子用量為5 g左右，最適反應時間控制在10 min之內，對于呼吸速率較小的材料則可適當延長反應時間。小籃子法的缺點是易受測試容器(廣口瓶)體積的限制而易將氧氣消耗完，若測試材料的呼吸速率較大，則可選用較大體積的廣口瓶或減少種子用量。此外，若受實驗條件限制只能采用傳統(tǒng)小籃子法測定呼吸速率，建議種子用量要盡量大，可減少實驗誤差。

改良小籃子法測定的實驗數(shù)據(jù)變異系數(shù)較傳統(tǒng)方法小，操作簡便，可實時監(jiān)測數(shù)據(jù)變化，人為和客觀影響因素較少，準確度較高，適用于大批量樣品的測定，這些優(yōu)點使其能更好地為科研服務并可應用于植物生理學實驗教學實踐，有利于學生掌握新的技術手段，培養(yǎng)學生的科學性和嚴謹性。

[1]黃真池，黃上志.不破壞種子活力測定方法研究Ⅱ種子活力與呼吸速率的關系[J].種子，1998，98(5)：3-5.

[2]王若蘭，嚴 佳，李燕羽，等. 不同條件下小麥呼吸速率變化的研究[J]. 河南工業(yè)大學學報：自然科學版，2009，30(4)：12-16.

[3]馮曉英，馬敏兵，陳慶富. 鑭對油菜種子萌發(fā)及其生理生化指標的影響[J].種子，2010，29(8)：45-47.

[4]馬成倉，李清芳，束良佐，等. 硅對玉米種子萌發(fā)和幼苗生長作用機制初探[J].作物學報，2002，28(5)：665-669.

[5]梁海榮，邢侗姬，周小梅. 不同活力的小麥種子生理生化及其修復的研究[J].山西大學學報:自然科學版， 2010，33( 2) : 286-290.

[6]陸秀君，王妮妮，李天來，等.不同浸種和催芽處理對天女木蘭種子的催芽效果[J]. 西北農林科技大學學報:自然科學版，2008，36(5)：135-140.

[7]王 進，張 勇，張有富，等.苦馬豆和披針葉黃華種子硬實特性與活力關系[J]. 植物生理學通訊，2010，46(12)：1219-1224.

[8]郁飛燕.干旱脅迫下硒對小麥種子萌發(fā)的影響[D]. 洛陽：河南科技大學，2012.

[9]張景峰. 六種野生薔薇屬植物種子萌發(fā)及休眠的研究[D]. 北京：北京林業(yè)大學，2009.

[10]王學奎.植物生理生化實驗原理和技術 [M]. (2版).北京：高等教育出版社，2006：165-166.

[11]Gillespie K M, Xu F, Richter K T, et al. Greater antioxidant and respiratory metabolism in field-grown soybean exposed to elevated O3under both ambient and elevated CO2[J]. Plant Cell Environ, 2012, 35(1):169-184.

[12]眭曉蕾， 張寶璽，張振賢，等. 不同品種辣椒幼苗光合特性及弱光耐受性的差異[J].園藝學報，2005，32(2)：222-227.

[13]Li X, Zhang G, Sun B, et al. Stimulated leaf dark respiration in tomato in an elevated carbon dioxide atmosphere [J]. Sci Rep, 2013(3):3433.

[14]王兆國，王傳寬．三種溫帶樹種葉片呼吸的時間動態(tài)及其影響因子[J].生態(tài)學報，2013，33( 5) : 1456-1464.

[15]徐佳佳. 晉西黃土區(qū)主要水土保持樹種光合和蒸騰特性研究[D].北京：北京林業(yè)大學，2012.

Improved method for measuring respiratory rate of plant seeds using small-skep-method

LI Hai-xia, XU Jiu-wei, CAI Ming-li, ZENG Han-lai, WANG Xue-kui

(National Experimental Teaching Demonstration Centre of Crop Science, College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

The small-skep-method measuring CO2respiratory rate of plant seeds was improved utilizing CO2Infrared Gas Analyzer. The results showed that the modified small-skep-method was simple in operation and could monitor the data changes real-timely. Compared with the traditional method, the experimental data measured by the modified method had higher accuracy, and the coefficient of variation was smaller. The modified small-skep-method could overcome the defects of the traditional method to some extent, and make more scientific and rigorous experimental determination, so which can be used for undergraduate plant physiology experimental teaching.

respiratory rate; small-skep-method; improved method; experimental teaching

2014-08-25；

2014-09-24

2010年校級重點課程建設項目(植物生理生化實驗系列課程)；2013年第三批國家級精品資源共享課立項項目(本科教育課程：植物生理學，序號796)

李海霞，實驗師，博士，從事植物生理生化實驗教學與管理， E-mail:lihx2011@mail.hzau.edu.cn；

王學奎，副教授，博士，從事植物生理學與基礎生物化學教學與研究，E-mail: wang-xuekui@mail.hzau.edu.cn。

Q945.3

B

2095-1736(2015)01-0100-03

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.01.100