反相HPLC法研究影響水稻維生素C含量的關(guān)鍵基因

趙洪慶, 賀香嫦， 林建忠， 周延彪， 許光明

(1. 湖南中醫(yī)藥大學 藥學院 湖南省教育廳中藥現(xiàn)代化重點實驗室， 長沙 410208；2. 湖南大學 生物學院， 長沙 410000)

反相HPLC法研究影響水稻維生素C含量的關(guān)鍵基因

趙洪慶1, 賀香嫦1， 林建忠2， 周延彪2， 許光明1

(1. 湖南中醫(yī)藥大學 藥學院 湖南省教育廳中藥現(xiàn)代化重點實驗室， 長沙 410208；2. 湖南大學 生物學院， 長沙 410000)

HPLC測定水稻葉中維生素 C (Vc)含量的測定方法，測定后比較轉(zhuǎn)基因水稻葉與普通水稻葉中Vc含量的差異，為尋找調(diào)控水稻中Vc含量的關(guān)鍵基因奠定基礎(chǔ)。草酸水溶液提取水稻葉中的Vc后，反相HPLC方法測定含量，選用的色譜柱為Diamonsil C18柱(250×4.6 mm,5 μm)，流動相為0.2%磷酸-甲醇，梯度洗脫，檢測波長245 nm,柱溫30℃。測的線性范圍為 1～40 μg/mL(r=0.9992)，平均回收率為98.51%，轉(zhuǎn)基因水稻葉組含量為(0.356±0.009)和(0.444±0.008) mg/g，而普通組Vc含量為(0.554±0.013) mg/g，統(tǒng)計軟件SPSS19.0分析表明二者有顯著差異(P<0.01) 。此方法測水稻葉中Vc含量具有簡便，快速，準確的特點；類受體蛋白激酶439即為影響水稻中Vc含量的關(guān)鍵基因。

轉(zhuǎn)基因；水稻葉中的Vc；HPLC；類受體蛋白439

維生素C(Vc)是一種重要的植物衍生的抗氧化劑，并且是構(gòu)成膳食Vc的主要來源。Vc對動植物的成長、應激反應起著重要的作用[1]。 Wheeler等提出的L-半乳糖途徑被公認為高等植物中合成ASA的主要途徑[2]。在擬南芥中，有9種酶被證明直接參與Vc的生物合成[ 3-8], 據(jù)文獻報道[2]，CSN5B(COP9信號亞基5B)能降解VTC1(Vc合成酶)，影響Vc的含量。而我們所研究的類受體蛋白激酶439，通過酵母雙雜交實驗，驗證能與CSN5B相互作用，預測蛋白激酶439是CSN5B的上游基因，可通過調(diào)控CSN5B來影響水稻中Vc含量。類受體蛋白激酶(RLK)是一類定位在質(zhì)膜上，包含胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)激酶域的膜蛋白。因為這類蛋白激酶的分子結(jié)構(gòu)和功能類似動物細胞中的受體蛋白激酶(RPK)[9-12]，并且絕大多數(shù)尚未鑒定出其配基，故稱為類受體蛋白激酶。CSN5B 在酵母和植物中能與VTC1的N末端相互作用，凝膠過濾譜表明VTC1-CSN5B也與COP9信號復合物有關(guān)，而這互動通過26S蛋白酶體途徑促進泛素依賴的VTC1降解。目前除了對水稻PMM和GME基因在分子和生化水平上的一些研究外，對其他參與Vc合成的基因報道較少[7-8,13-15]。

通過培育轉(zhuǎn)基因439、COP9過表達的水稻苗，采用高效液相色譜法對水稻葉進行Vc含量測定，觀察轉(zhuǎn)基因水稻葉中Vc含量的變化情況,為尋找調(diào)控水稻葉片Vc含量的基因提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(Agilent Technologies 1200，安捷倫儀器公司)；5417R高速冷凍離心機(Eppendor)；液氮(湖南大學提供)；Vc標準品(購自湖南省藥檢所)；甲醇(HPLC純，購自長沙天恒試劑公司，下同)，磷酸，草酸，三乙胺，以上試劑除說明的外均為分析純。二次蒸餾水(自制)，轉(zhuǎn)基因水稻葉和正常水稻葉(湖南大學生物學院培育)。

1.2 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱(5 μm ，250 ×4.6 mm)；流動相：A相為0.2%磷酸溶液(用三乙胺回調(diào)pH值至4.0)，B相為甲醇，梯度洗脫程序為：0、7、15、30 min時對應的B%分別為5、5、25、85，總流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：245 nm；進樣量：20 μL。

1.3 對照品溶液的配制

精稱取Vc對照品0.4 g,至于100 mL棕色容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.4000 mg/mL的對照品儲備溶液。分別取0.400 mg/mL的Vc對照品溶液0.25、1.25、2.50、2.75、6.25和10.00 mL于100 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，得1.00、5.00、10.00、15.00、25.00和40.00 μg/mL的標準系列，搖勻，0.45 μm濾膜過濾，待用。

1.4 樣品溶液的配制

按農(nóng)桿菌介導的水稻轉(zhuǎn)化方法培育一定時間后，準確稱取0.2 g轉(zhuǎn)基因439、COP9過表達水稻和正常水稻新鮮葉片，液氮下研磨成粉末，然后加5 mL 0.1%的草酸混勻，冰浴5 min，12000 r/min離心10 min。吸取上清液用0.45 μm濾膜過濾，稀釋至標準液的線性濃度范圍，進樣測試，測試的色譜圖如圖1，Vc的色譜峰保留時間為4.17 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 試液制備及儲存

由于Vc在空氣中極易被氧化，尤其是在堿性條件下更快，而在酸性介質(zhì)中，它受空氣氧化的速度稍慢。因而用0.1%的草酸來配制Vc標準溶液。實驗過程中，24 h內(nèi)的測試結(jié)果較為穩(wěn)定，但溶液經(jīng)過36 h后，氧化現(xiàn)象明顯，72 h后測試時有近一半的Vc被氧化了。在提取過程中，0.1%草酸液進行提取還考慮了抑制抗壞血酸氧化酶的原因。

圖1 HPLC檢測Vc色譜圖結(jié)果

2.2 色譜條件的選擇

參照文獻[16-17]，根據(jù)Vc的紫外吸收情況，選擇245 nm作為檢測波長?？紤]到測試需要，Vc出峰時間是在前段，為了節(jié)省試劑及分析時間，后端出的組分的分離加以忽略了，因而選擇了如1.2的梯度洗脫條件，較好地實現(xiàn)了目標峰的分離檢測。

實驗中，由于Vc在水溶液中的離解作用，導致色譜峰會由于固定相吸附作用而拖尾，流動相中加入一定的酸會起到抑制離解作用，且能保護Vc避免被氧化。經(jīng)試驗，最終流動相確定為0.2%磷酸溶液-甲醇體系。為了防止磷酸導致流動相的酸度過大而影響色譜柱，用三乙胺回調(diào)酸度至pH值為4.0左右。實驗結(jié)果表明測試中色譜峰拖尾現(xiàn)象得到了較好的控制。

2.3 精密度試驗

取同一濃度對照品溶液，連續(xù)進樣5次，每次20 μL，測得峰面積，計算相對標準偏差RSD為1.96%，表明精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗

取同一樣品液分別于0、2、4、6和8 h進樣20 μL,峰面積基本不變，RSD為2.09%，表明樣品液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復性試驗

取同一批次的樣品液，按樣品液制備項下操作，平行制備5份，測得含量，計算RSD為2.11%，說明該樣品成分測定的重復性良好。

2.6 標準工作曲線

將1.4制備的標準溶液，分別進樣20 μL，記錄峰面積，得測試V c的標準工作曲線。線性回歸方程為：Y=57.40X-46.75(r=0.9992),表明在測試過程中Vc在1～40μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.7加標回收率試驗

取6份同樣的樣品，按樣品處理方法平行處理，按等濃度加標方法，每份等量加入Vc標準品，測試回收率情況，試驗結(jié)果如表1，得平均回收率為98.51%，RSD為1.91%。測試的準確性達到要求。

表1 樣品加標回收率測量結(jié)果

2.8 樣品含量測定

取5批次的2組不同轉(zhuǎn)基因水稻葉樣品與普通水稻葉樣品，每批次測來自不同植株的葉片6片的含量，按樣品處理方法處理，取平均值得每批葉片中Vc含量。5個批次的測量結(jié)果如表2。用SPSS19.統(tǒng)計分析軟件進行分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻葉樣品與普通水稻葉中的Vc含量有明顯差別(P<0.01)

表2 不同批次的轉(zhuǎn)基因和普通水稻葉中Vc含量比較

*—與普通水稻組比較 (P<0.01)。

3 結(jié)論

建立的高效液相方法分析水稻中的Vc含量，該方法能對主要組分進行完全分離，對非定量組分快速洗脫，從而節(jié)省了分析時間和流動相。實驗中，為防止Vc的離解作用導致色譜峰拖尾而影響定量的精密度和準確性，流動相中加入0.2%磷酸溶液。同時為防止磷酸酸度過大而影響色譜柱，用三乙胺回調(diào)酸度至pH值4.0左右。實驗結(jié)果表明測試中色譜峰拖尾現(xiàn)象得到了控制，該定量方法的線性范圍寬，回收率、精密度和重復性均較高，適合于水稻葉等的Vc含量分測定。

實驗表明，普通水稻葉組(對照組)Vc含量最高，COP9過表達組次之，439過表達組最低。由于COP9能夠降解Vc合成酶(VTC1)，所以COP9過表達組比對照組中Vc含量要低，又由于439能夠激活COP9，使COP9降解活性增高，所以使Vc含量進一步降低。本文通過對水稻Vc含量的研究，找到了調(diào)控水稻葉片Vc含量的關(guān)鍵基因，為水稻Vc的合成與降解提供了理論研究依據(jù)，更好地為水稻的分子育種提供了廣闊的前景。

[1]Conklin P L, Williams E H, Last R L. Environmental stress sensitivity of an ascorbic acid-deficientArabidopsismutant[J]. Proc Acad Sci, 1996, 93(18): 9970-9974.

[2]Wheeler G L, Jones M A, Smirnoff N. The biosynthetic pathway of vitamin C in higher plants[J]．Nature, 1998, 393(5): 365-369.

[3]Tahata K, Oba K, Suzuki K. et al．Generation and properties of ascorbic acid deficient transgenic tobacco cells expressing antisense RNA for L-galactono-1,4-lactone-dehydrogenase[J]. Plant J, 2001, 27(2):139-148.

[4]Wolucka B A, Persiau G, Doorsaelaere J V, et a1．Partial purification and identification of GDP-mannose 3", 5"-epimeraac ofArabidopsisthaliana，a key enzyme of the plant vitanmin C pathway[J]．Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(26):14843-14848.

[5]Gatzek S, Wheeler G L, Smirnoff N．Antisense suppression of L-galactose dehydrogenase inArabidopsisthalianaprovides evidence for its role in ascorbate synthesis and reveals light modulated L-galactose synthesis [J].Plant J, 2002, 30(4): 541-553.

[6]Linster C L, Clarke S G. L-ascorbatc biosynthesis in higher plants：the role of VTC2 [J]. Trends Plant Sci, 2008,13(11):567-573.

[7]Qian W, Yu C, Qin H, et al. Molecular and functional analysis of phosphomannomutase(PMM) from higher plants and genetic evidence for the involvement of PMM in ascorbic acid biosynthesis inArabidopsisandNicotianabenthamiana[J]. Plant J, 2007, 49(3): 399-413.

[8]Maruta T, Yonemitsu M, Yahuta Y, et a1. Arabidopxis phosphomannose isomerasel. but not phosphomannose isomerase 2, is essential for ascorbic acid biosynthesis[J]. J Biol Chem, 2008, 283(43): 28842-28851.

[9]Wang J, Yu Y W, Zhang Z J.ArabidopsisCSN5B interacts with VTC1 and modulates ascorbic acid synthesis[J]. The Plant Cell, 2013, 25(2): 625-636.

[10]Hanks H K, Ouinn A M, Hunter T. The protein kinase family: conserved feature and deduced phylogeny of the catalytic domains[J]. Science, 1988, 241(4861) :42-52.

[11]Yarden Y, Ullrich A. Growth factor receptor tyrosine kinases[J]. Annu Rev Biochem, 1988, 57: 443-478.

[12]Ullrich A, Schlessinger J. Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity[J]. Cell, 1990, 61(2): 203-212.

[13]Fransson L A, Mani K. Novel aspects of vitamin C：how important is glypican 1 recycling[J]. Trends Mol Med, 2007, 13(4): 143-149.

[14]Watanabe K, Suzuki K, Kitamura S. Characterization ot a GDP-D-mannose 3"，5"-epimerase from rice [J]. Phytochemistry, 2006, 67(4): 338-346.

[15]張桂云，徐 根，于恒秀等. 水稻維生素C合成相關(guān)基因的表達分析[J]. 揚州大學學報：農(nóng)業(yè)與生命科學版，2011,32(1):15-19.

[16]迪麗努爾.馬里克，沙拉買提，曼蘇爾.高效液相色譜法測定野薔薇果中Vc含量的研究[J].食品研究與開發(fā)，2008,29(7):87-89.

[17]黃桂穎，陳悅嬌，白衛(wèi)東.RP-HPLC測定夏橙中Vc含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2008,36(6):2197-2198.

Study on regulation of the key genes on Vitamin C content in the rice by HPLC

ZHAO Hong-qing1， HE Xiang-chang1， LING Jian-zhong2,ZHOU Yan-biao2, XU Guang-ming1

(1. Key Laboratory of Modernization Education, College of Pharmaceutical Science, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208; 2. Biology School， Hunan University , Changsha 410000, China)

The difference of Vc content in leaves was compared between transgenic rice and ordinary rice to find the key genes which regulate the Vc content. Leaf Vc in the rice leaves was extracted with oxalic acid solution. The determination was performed with RP-HPLC on Diamonsil C18 column(250×4.6 mm,5 μm) under the condition of gradient elution with 0.2% phosphoric acid-methanol as mobile phase, detection wavelength of 245 nm and column temperature at 30℃. The detection linear range was 1-40 μg/mL(r=0.9992) and average recovery was 98.51%. The statistic analysis with SPSS19.0 soft showed significant differences(P<0.01) of Vc content between transgenic rice leaf group, (0.356±0.009) and (0.444±0.008) mg/g, and the normal group, (0.554±0.013) mg/g. Result showed that this method was simple, rapid and accurate for determination of Vc in rice leaf. The result indicated that receptor protein 439 was the key gene for regulation on Vc content in the rice.

transgenic；Vc in rice leaves；HPLC；receptor protein 439

2014-07-15；

2014-08-19

湖南省教育廳科研項目(11C0943，11C0952)資助；湖南省中藥學重點學科建設項目

許光明，副教授，博士，研究方向為生物醫(yī)藥分，E-mail：1052262329@qq.com。

S511

A

2095-1736(2015)01-0052-03

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.01.052