鄰苯二甲酸酯類(PAEs)對(duì)三角魴的急性毒性研究

張威振，賴子尼，趙李娜，王 超，高 原，楊婉玲

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部珠江流域漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心 珠江水域漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)功能實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510380； 2. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海 201306)

鄰苯二甲酸酯類(PAEs)對(duì)三角魴的急性毒性研究

張威振1,2，賴子尼1，趙李娜1，王 超1，高 原1，楊婉玲1

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部珠江流域漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心 珠江水域漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)功能實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510380； 2. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海 201306)

為了研究鄰苯二甲酸酯對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)的危害，以三角魴(MagalobrameTarminalis)幼魚(yú)為研究對(duì)象，探討鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二甲酯(DMP) 、鄰苯二甲酸二-2-乙基己酯(DEHP) 、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)4種PAEs化合物對(duì)其急性毒性效應(yīng)。結(jié)果表明：以上4種化合物在暴露24 h、48 h 和96 h 的半致死質(zhì)量濃度( LC50) 分別為2.75、2.41和2.08 mg/L；5.29、4.12和3.29 mg/L；6.56、6.15和5.41 mg/L和6.98、6.84和6.60 mg/L。其安全濃度(SC)分別為0.55、0.79、1.62和2.00 mg/L。三角魴幼魚(yú)對(duì)4種PAEs化合物的中毒癥狀相似，但4種物質(zhì)的致死濃度區(qū)間存在差別，4種物質(zhì)對(duì)三角魴幼魚(yú)的毒性大小順序?yàn)镈BP>DMP>DEHP>DEP，三角魴幼魚(yú)對(duì)4種PAEs化合物均表現(xiàn)出顯著的時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng)，呈正相關(guān)。結(jié)果表明，4種物質(zhì)在試驗(yàn)濃度下對(duì)三角魴幼魚(yú)產(chǎn)生了明顯的毒性作用，對(duì)水生生物存在危害，應(yīng)對(duì)其水生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)加以關(guān)注。為制定4種PAEs水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)及對(duì)其進(jìn)行生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

鄰苯二甲酸酯；三角魴幼魚(yú)；半致死濃度( LC50)；安全濃度(SC)

鄰苯二甲酸酯(Phthalate Esters. PAEs)也稱酞酸酯，是大約30種化合物的總稱，主要作為增塑劑被用于塑料生產(chǎn)[1]。目前，隨著塑料制品的大量使用，PAEs對(duì)環(huán)境的污染也越來(lái)越嚴(yán)重，其中鄰苯二甲酸二丁酯(Di-n-butyl phthalate，DBP) 、鄰苯二甲酸二甲酯(Dimethyl phthalate，DMP)及鄰苯二甲酸二-2-乙基己酯(Di(z-etylhexyl) phthalate，DEHP)、鄰苯二甲酸二乙酯(Diethyl phthalate，DEP) 4種PAEs化合物已被美國(guó)環(huán)保局(Environmental Protection Agency，EPA)列入重點(diǎn)控制的污染物名單中[2]。中國(guó)也將DMP、DBP列為環(huán)境優(yōu)先污染物[3]。PAEs是一類環(huán)境激素[4]，威脅人類健康以及對(duì)藻類[5]、浮游生物[6]和魚(yú)類的繁殖、發(fā)育產(chǎn)生有害影響[7]。

三角魴(MagalobrameTarminalis)，主要分布于長(zhǎng)江中下游、黃河、黑龍江、珠江及東部沿海諸水系。它體大肉厚、骨刺比較少、肉質(zhì)嫩滑，可稱為淡水魚(yú)類中的珍品。目前，對(duì)三角魴的遺傳性狀[8]、人工繁殖[9]等方面均有研究，但關(guān)于PAEs 類化合物對(duì)三角魴的急性毒性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

研究探討DMP、DEP、DBP和DEHP 4種PAEs 類化合物對(duì)三角魴幼魚(yú)的急性毒性，觀察其毒性反應(yīng)并比較了4種化合物的毒性差異，為PAEs類化合物環(huán)境安全性評(píng)價(jià)及生態(tài)毒理學(xué)相關(guān)研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

YSI水質(zhì)檢測(cè)儀；電子分析天平；倒置光學(xué)顯微鏡；DMP、DEP、DBP、DEHP標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98.5%)，購(gòu)自德國(guó)DR公司；助溶劑農(nóng)乳2201，購(gòu)自江蘇省海安石油化工廠。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)

實(shí)驗(yàn)魚(yú)購(gòu)自佛山市南海三角魴育苗場(chǎng)，在室內(nèi)喂養(yǎng)1個(gè)月，每天早晚各投餌1次，隔天換水，每次換水1/2，自然死亡率<0.1%。平均體長(zhǎng)為3.88 cm, 平均全長(zhǎng)4.86 cm，平均體重為1.05 g。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)條件

實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)進(jìn)行，用YSI水質(zhì)檢測(cè)儀測(cè)得實(shí)驗(yàn)水溫為18～22 ℃，pH值為7.5～ 8.0，溶氧為5.78～ 6.28 mg/L，總硬度為128 mg/L(以CaCO3計(jì))。玻璃容積規(guī)格為60 cm×40 cm×50 cm。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)采用凈水法生物測(cè)試

按照《水污染魚(yú)類毒性實(shí)驗(yàn)方法》[10]，參考預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果配成5個(gè)不同濃度梯度(表1)設(shè)置最大助溶劑濃度(受試液中助溶劑體積分?jǐn)?shù)<0.1%)。及空白對(duì)照。實(shí)驗(yàn)時(shí)，每組放入實(shí)驗(yàn)魚(yú)15尾，設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)。

表1 實(shí)驗(yàn)藥物的質(zhì)量濃度

1.2.2 臨時(shí)裝片制作

采用直接蓋片法[11]制作臨時(shí)裝片。

首先氨或者尿素等氨基還原劑氣化后噴入爐內(nèi)，或者是先噴入爐內(nèi)借助煙氣熱量氣化，之后在合適的溫度范圍（一般稱為溫度反應(yīng)窗口）內(nèi)，氣態(tài)氨或者尿素等氨基還原劑產(chǎn)生活性分子（NH3或者NH2）經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)后，氨基活性分子與NOx接觸并將其還原成N2和H2O。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS(14.0)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)質(zhì)量濃度-死亡率一元回歸，計(jì)算不同暴露時(shí)間下的半致死濃度LC50。并按照公式SC=48 hLC50×0.3/(24 hLC50/48 hLC50)2[10]，求出安全質(zhì)量濃度。

為評(píng)價(jià)化合物毒性的強(qiáng)弱，根據(jù)魚(yú)類96 h急性中毒試驗(yàn)的半致死質(zhì)量濃度(LC50)，有毒物質(zhì)對(duì)魚(yú)類的毒性作用標(biāo)準(zhǔn)分為5級(jí)[12](表2)。

表2 魚(yú)類急性毒性實(shí)驗(yàn)毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)癥狀

在以上實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組魚(yú)均表現(xiàn)正常。各物質(zhì)最高濃度組的魚(yú)先出現(xiàn)水中躁動(dòng)，向水面竄游，呼吸頻率加快，有個(gè)別魚(yú)急速旋轉(zhuǎn)游動(dòng)，一段時(shí)間后出現(xiàn)側(cè)泳、乏力，反應(yīng)遲滯，最后沉于水底死亡癥狀，直至死亡，死亡魚(yú)體多表現(xiàn)為鰓部充血，身體出現(xiàn)彎曲癥狀，腹部變淡黃色，體色變暗，個(gè)別魚(yú)眼球突出；最低濃度組在短時(shí)間內(nèi)和對(duì)照組之間無(wú)差別，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，開(kāi)始出現(xiàn)中毒癥狀。三角魴幼魚(yú)對(duì)4種PAEs物質(zhì)中毒癥狀類似，但死亡時(shí)間及濃度范圍存在差異。DBP濃度為4.20 mg/L時(shí)，4 h后三角魴幼魚(yú)出現(xiàn)中毒癥狀，5 h后出現(xiàn)死亡；DMP濃度為7.50 mg/L時(shí)，2 h后三角魴幼魚(yú)出現(xiàn)中毒癥狀，5 h后出現(xiàn)死亡；DEHP濃度為8.70 mg/L時(shí)，1.5 h后三角魴幼魚(yú)出現(xiàn)中毒癥狀，3 h后出現(xiàn)死亡。DEP濃度為10.00 mg/L時(shí)，1 h后三角魴幼魚(yú)出現(xiàn)中毒癥狀，2 h后出現(xiàn)死亡。

2.2 三角魴幼魚(yú)在4種PAEs物質(zhì)各濃度及時(shí)間下的死亡率

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中空白對(duì)照組死亡率為零，且各平行試驗(yàn)組中死亡個(gè)數(shù)無(wú)明顯差別，以下4種PAEs不同暴露時(shí)間下的死亡率均采用平均死亡率，各實(shí)驗(yàn)組魚(yú)死亡率隨著物質(zhì)濃度的加大而增加；在同一濃度條件下，死亡率隨著時(shí)間的增加而增加(表3)。

表3 PAEs不同暴露時(shí)間下三角魴幼魚(yú)的死亡率

ANOVA檢驗(yàn)結(jié)果表明，DBP、DMP、DEHP和DEP各自濃度之間的F值分別為218.42、45.17、33.10和80.02，均遠(yuǎn)大于F0.01(5.95)且P<0.01，表明不同濃度的4種PAEs化合物對(duì)三角魴幼魚(yú)的致死率均有極顯著的影響。DBP、DMP、DEHP各自暴露時(shí)間之間的F值分別為17.92、9.42和11.13均大于F0.01(5.95)且P<0.01，表明不暴露時(shí)間的4種PAEs化合物對(duì)三角魴幼魚(yú)的致死率均有極顯著的影響。而DEP各自暴露時(shí)間之間的F值為5.00介于F0.05(3.26)和F0.01(5.95)之間，且0.01

2.3 4種PAEs對(duì)三角魴幼魚(yú)毒性的差異

通過(guò)對(duì)PAEs質(zhì)量濃度與三角魴幼魚(yú)死亡率的回歸關(guān)系分析得出三角魴暴露不同暴露時(shí)間下的LC50，如表4所示?？傻肈BP、DMP、DEHP和DEP對(duì)三角魴幼魚(yú)48 h的LC50值分別為2.41、4.12、6.15和6.84 mg/L；安全濃度分別為0.55、0.79、1.62和2.00 mg/L。其中DMP的12 h半致死濃度超出實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度。

表4可得，多數(shù)確定系數(shù)(R2)值大于0.90，相關(guān)較顯著。且三角魴幼魚(yú)在含4種PAEs化合物的水中暴露后的死亡率和其濃度均呈正相關(guān)，其中DBP、DMP的相關(guān)性較高。由于DBP、DMP、DEHP和DEP各自濃度之間對(duì)三角魴幼魚(yú)的致死率均有極顯著的影響，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得安全濃度比較三角魴幼魚(yú)對(duì)4種PAEs的安全濃度由小到大順序DBP、DMP、DEHP和DEP。

表4 PAEs質(zhì)量濃度與三角魴幼魚(yú)死亡率的回歸關(guān)系

x—化合物的濃度；y—實(shí)驗(yàn)魚(yú)的死亡率。

2.4 顯微觀察結(jié)果及分析

分別取最高濃度下4種PAEs化合物致死幼魚(yú)的鰓絲做臨時(shí)裝片，在顯微鏡下(5×40)進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖1。

圖1 中毒個(gè)體鰓的特征

a—DBP 為4.20 mg/L時(shí)5 h中毒魚(yú)鰓; b—DMP 為7.5 mg/L 時(shí)5 h中毒魚(yú)鰓; c—DEHP為 8.7 mg/L時(shí)3 h中毒魚(yú)鰓; d—DEP 為10.0 mg/L時(shí)2 h中毒魚(yú)鰓; e—正常魚(yú)鰓。

由圖1發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)魚(yú)的鰓部均有明顯充血現(xiàn)象，4.20 mg/L DBP和8.7 mg/L DEHP中毒魚(yú)鰓出血最明顯。

3 討論

自20世紀(jì)70年代以來(lái)就有關(guān)于鄰苯二甲酸酯類化合物毒性作用的研究和報(bào)道，但是過(guò)去幾十年，人們普遍認(rèn)為鄰苯二甲酸酯類化合物毒性作用較低且具有良好的理化性質(zhì)，因而大量投入生產(chǎn)和使用。但近年研究表明該類化合物除具一般毒物所具的毒性外，還具有其自身特殊的毒性，如環(huán)境激素[4]、致畸、致癌[5]等作用，鄰苯二甲酸酯類化合物已經(jīng)成為環(huán)境中重要的有機(jī)污染物之一，其生態(tài)毒性也越來(lái)越被重視。

林玲等[13]研究發(fā)現(xiàn)，成年斑馬魚(yú)被DBP染毒1個(gè)月后，0.062 mg/L的劑量即可導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育遲緩，因此，即使在安全濃度之下其慢性毒性亦不容忽視；秦潔芳等[14]研究發(fā)現(xiàn)DEHP對(duì)紅鰭笛鯛幼魚(yú)組織酶活性在試驗(yàn)濃度下影響顯著，對(duì)水生生物存在氧化脅迫、神經(jīng)毒性等危害。

Yang等[15]研究了DBP、DMP、DEP和DEHP等化合物對(duì)鮑(Haliotisdiversicolorsupertexta)的胚胎毒性試驗(yàn)，得出幾種PAEs的毒性大小為DBP﹥DMP﹥DEP﹥DEHP，有研究認(rèn)為由于DEHP側(cè)鏈較長(zhǎng)，有較高的脂溶性，使其難于滲透到胚胎細(xì)胞中，因此出現(xiàn)了毒性相對(duì)較低[16]。有報(bào)道4種PAEs化合物對(duì)綠藻(Selenastrumcapricornutum)的毒性大小為DEHP> DBP> DEP> DMP[17]。何秀婷[18]等根據(jù)48 h的LC50得出，4種PAEs化合物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎毒性大小順序依次為DBP>DEHP>DEP>DMP。Naoki等[19]研究表明，3種PAEs對(duì)蝦(BrineShrimp)卵的毒性大小為DBP> DEP>DMP。而本研究得出4種PAEs化合物對(duì)三角魴幼魚(yú)急性毒性大小順序?yàn)镈BP>DMP>DEHP>DEP。本研究結(jié)果顯示DBP在96 h三角魴幼魚(yú)的LC50為2.08 mg/L，與其對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)96 h的LC50(2.91 mg/L)接近，但低于其對(duì)虹鱒(salmogairdner)96 h的LC50(6.47 mg/L)[20]及斑馬魚(yú)96 h的LC50(8.51 mg/L)[21]?？梢?jiàn)，PAEs對(duì)不同水生生物的毒性效應(yīng)不盡相同。

研究結(jié)果表明4種PAEs化合物對(duì)三角魴幼魚(yú)的LC50與暴露時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，可推斷4種PAEs對(duì)三角魴幼魚(yú)具有一定的累積毒性。隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，相鄰LC50的差值總體上呈先下降后增加趨勢(shì)，可推斷暴露時(shí)間和死亡率呈正相關(guān)但其對(duì)死亡率影響在一定時(shí)間內(nèi)逐漸減小，當(dāng)在魚(yú)體累積到一定程度，毒性增強(qiáng)。

鰓是魚(yú)在水體中進(jìn)行氣體交換和離子轉(zhuǎn)移、毒物吸收、生物轉(zhuǎn)化和排泄的重要器官[22]，受毒害時(shí)，鰓比其他組織更迅速的積累這些化合物[23]。據(jù)此推測(cè)，在PAEs較高濃度下，幼魚(yú)通過(guò)呼吸，使得化合物被鰓吸附，在鰓中凝結(jié)和沉淀，魚(yú)鰓絲卷曲和絮亂，使鰓表面水的摩擦力加大，給氣體交換帶來(lái)困難，使魚(yú)因缺氧死亡?；蚴且?yàn)榛衔镌斐肾w外表皮細(xì)胞損傷，血球有溶解，使得細(xì)胞調(diào)節(jié)滲透能力受損，造成鰓絲充血無(wú)法正常呼吸而死。具體原因有待進(jìn)一步研究。雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者們對(duì)魚(yú)鰓進(jìn)行了一系列研究，如重金屬離子的毒性作用，中毒后重金屬離子在魚(yú)鰓中的分布與富集，及由此引起的生理功能的變化等[23]。但對(duì)魚(yú)鰓因PAEs引起的毒性研究，目前國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)報(bào)道。

4 結(jié)論

1)DBP、DMP、DEHP和DEP對(duì)三角魴48 h的LC50值分別為2.41、4.12、6.15和6.84 mg/L；安全濃度分別為0.55、0.79、1.62和2.00 mg/L。

2)根據(jù)國(guó)際上外來(lái)化合物對(duì)魚(yú)類急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，以上4種PAEs化合物對(duì)三角魴魚(yú)的半致死濃度均分布在1～100 mg/L之間，毒性等級(jí)為高毒性。毒性大小順序?yàn)镈BP>DMP>DEHP>DEP。對(duì)水生生物產(chǎn)生一定危害，應(yīng)適當(dāng)控制PAEs化合物的使用，并對(duì)其環(huán)境遷移規(guī)律及環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)加以關(guān)注。

3)不同濃度4種PAEs化合物對(duì)三角魴的致死率都有極顯著的影響。而除了DEP暴露時(shí)間對(duì)三角魴的致死率未達(dá)到極顯著水平外，其他3種PAEs化合物的暴露時(shí)間對(duì)三角魴的致死率均達(dá)到極顯著水平。

4)研究結(jié)果表明不同種類的PAEs化合物對(duì)同種水生生物的毒性效應(yīng)各有不同，可能同物質(zhì)結(jié)構(gòu)及生物本身代謝等有關(guān)，但PAEs對(duì)三角魴慢性毒性有待進(jìn)一步探究。

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Acute toxicity study of phthalate esters (PAEs) on theMagalobrameTarminalis

ZHANG Wei-zhen1,2, LAI Zi-ni1, ZHAO Li-na1, WANG Chao1，GAO Yuan1, YANG Wan-ling1

(1. Fishery Eco-environment Monitoring and Evaluation Function Laboratory of Pearl River Valley, Fishery Eco-environment Monitor Center of Pearl River Valley, Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380; 2. College of Aquatic and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The purpose of this study is to evaluate the toxicities of PAEs to aquatic ecosystem. TakingMagalobrametarminalisJuvenile as sample，we studied the toxicity of dibutyl phthalate (DBP), dimethyl phthalate (DMP), di-2-ethylhexyl (DEHP) and diethyl phthalate (DEP) onMagalobrametarminalisJuvenile. The results showed that the 24 h, 48 h and 96 h LC50value of four compounds onMagalobrametarminalisJuvenile were 2.75, 2.41 and 2.08 mg/L; 5.29, 4.12 and 3.29 mg/L; 6.56, 6.15 and 5.41 mg/L and 6.98, 6.84 and 6.60 mg/L, respectively. The safe concentrations (SC) of 4 PAEs onMagalobrametarminalisJuvenile were 0.55, 0.79, 1.62 and 2.00 mg/L， respectively. The poisoning symptoms of four kinds of PAEs compounds onMagalobrametarminalisJuvenile were similar, but there were difference among lethal concentration of four kinds of substances. The toxicity of 4 PAEs toMagalobrametarminalisJuvenile was ranked as followed DBP> DMP> DEHP> DEP. Significant time effect and dose effect about four kinds of PAEs compounds onMagalobrametarminalisJuvenile were positively correlated. Results demonstrated that 4 PAEs, which had obvious toxic effects onMagalobrametarminalisJuvenile, were harmful to aquatic organisms, and it should be paid attention to its potential ecological risks on aquatic ecosystem, which can be used as ecosystem risk assessment and 4 PAEs water quality criteria setting.

PAEs;MagalobrametarminalisJuvenile;LC50; SC(Safety concentration)

2014-06-16；

2014-08-20

廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)A201101I02；廣西省自然科學(xué)重大項(xiàng)目(2013GXNSFEA053003)

張威振，碩士，研究方向?yàn)橛袡C(jī)污染物殘留及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，zwz0725@126.com;

賴子尼，研究員，研究方向?yàn)闈O業(yè)環(huán)境保護(hù)研究，znlai01@163.com。

R99

A

2095-1736(2015)01-0026-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.01.026