銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥的耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

張 妍 綜述，張 立 審校

（海河醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津300350）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）屬假單胞菌屬，革蘭陰性桿菌，是醫(yī)院感染的重要條件致病菌，能引起人和動(dòng)物的感染，也是慢性感染的常見致病菌，治療非常困難。美國(guó)國(guó)家醫(yī)院感染監(jiān)測(cè)系統(tǒng)（NNIS）報(bào)告指出PA 在所有院內(nèi)感染致病菌中檢出率居第5 位，在革蘭陰性菌中檢出率居第2位［1］。近年來由于大量抗菌藥物的廣泛使用，PA 耐藥率在逐年遞增，多藥耐藥PA 的數(shù)量和耐藥率不斷上升［2］，為臨床帶來很大困難。PA 具有目前已知的細(xì)菌耐藥的主要機(jī)制，已經(jīng)成為引起院內(nèi)獲得性肺炎多重耐藥的代表性革蘭陰性菌［3－4］。

碳青霉烯類抗菌藥物是新型的β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物，具有高效廣譜的特點(diǎn)，是治療PA 感染的關(guān)鍵藥物之一，對(duì)大多數(shù)β－內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，通過滲透細(xì)菌外膜作用進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)，殺菌活性強(qiáng)大［5］。近年來，隨著大量抗菌藥物的使用，特別是碳青霉烯類藥物的使用，PA 耐藥率不斷上升，而各種β－內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是PA 對(duì)抗菌藥物的各種耐藥機(jī)制中最主要的機(jī)制［6］。本文就PA 的這一耐藥機(jī)制作一綜述。

1 PA 的生物學(xué)特性

PA 又名綠膿桿菌，為人體正常菌群，是臨床常見的條件致病菌，專性需氧菌，廣泛存在于醫(yī)院環(huán)境，引起院內(nèi)免疫力低下患者感染。其主要引發(fā)的感染有肺部感染、心內(nèi)膜炎以及敗血癥等，由于菌體很難清除，常引起感染的反復(fù)發(fā)作［7－8］。國(guó)內(nèi)有文獻(xiàn)報(bào)道，老年患者由于多器官功能衰退，PA 也已成為了老年患者感染的主要致病菌，檢出率28.2%，占致病菌的首位［9］。此外，侵入性操作，如氣管插管、留置導(dǎo)尿管、纖維支氣管鏡等會(huì)引起機(jī)械性損傷減低防御功能，從而導(dǎo)致PA 傳播及細(xì)菌耐藥性的發(fā)展［10－11］。燒傷、創(chuàng)傷患者創(chuàng)面為PA 的定植感染創(chuàng)造條件。劉樹華等［12］的研究顯示迄今為止，引起燒傷患者醫(yī)院感染的細(xì)菌仍以革蘭陰性桿菌為主，其中PA 最常見，當(dāng)患者出現(xiàn)皮膚黏膜損壞及免疫功能下降時(shí)，容易導(dǎo)致創(chuàng)面PA 感染。

2 碇青霉烯類抗菌藥物的抑菌機(jī)制

碳青霉烯類抗菌藥物是新型β－內(nèi)酰胺類藥物，其中亞胺培南為世界上第一個(gè)碳青霉烯類抗菌藥物［13］，該藥物抗菌譜廣、活性強(qiáng)，對(duì)β－內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定。亞胺培南對(duì)β－內(nèi)酰胺酶有耐受作用，對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁外膜有較好的穿透性，抑制細(xì)胞壁黏肽的合成，通過阻礙細(xì)胞壁合成而起殺菌作用，它對(duì)大腸埃希菌等細(xì)菌的殺菌作用與第三代頭孢菌素類相似，而它對(duì)PA 和厭氧菌有較強(qiáng)大的作用。

3 PA 的耐藥現(xiàn)狀

PA 對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率在整個(gè)世界范圍內(nèi)為逐年上升的趨勢(shì)。亞太地區(qū)耐藥監(jiān)測(cè)在2010 年有報(bào)道顯示，PA 對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為27.7%和21.6%［14］。在我國(guó)，各地區(qū)的PA 對(duì)兩種藥物的耐藥性也越來越高，其中華東地區(qū)高達(dá)25.7%和22.5%［15］。武曉敏等［16］研究報(bào)道稱，PA 對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率高達(dá)30%以上。彭超等［17］研究報(bào)道稱，在神經(jīng)內(nèi)科檢測(cè)出的PA 菌200例與19中抗菌藥物耐藥性檢測(cè)中，美羅培南的耐藥性為25%，而耐藥率最低的為多黏菌素E，為8%。PA 對(duì)抗菌藥物耐藥率不斷的升高正是由于近年來碳青霉烯類抗菌藥物的大量廣泛使用。

4 PA 的耐藥機(jī)制

PA 的耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣，外膜蛋白是許多抗菌藥物進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)的通道，由于PA 的外膜上有許多微孔通道蛋白，使多種革蘭陰性菌的抗菌藥物難以通過，從而具有很多種抗菌藥物的天然耐藥性，同時(shí)也會(huì)因?yàn)榛虻耐蛔兌@得耐藥性，所以產(chǎn)生β－內(nèi)酰胺酶，外膜的通透性障礙，形成生物膜，主動(dòng)外排系統(tǒng)的表達(dá)等均是其主要的耐藥機(jī)制［18］。

4.1 β－內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生 PA 對(duì)β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥主要是它可以產(chǎn)生多種β－內(nèi)酰胺酶［19］，此酶可以通過水解或非水解方式破壞β－內(nèi)酰胺環(huán)，使抗菌藥物相應(yīng)失活。PA 產(chǎn)生的β－內(nèi)酰胺酶主要包括金屬β－內(nèi)酰胺酶（MBLs）、超廣譜β－內(nèi)酰胺酶（ESBLs）、頭孢菌素酶（AmpC酶）。

4.1.1 MBLs MBLs又稱碳青霉烯酶或金屬酶，主要存在于鮑曼不動(dòng)桿菌和PA 中，能水解碳青霉烯類抗菌藥物在內(nèi)大多數(shù)β－內(nèi)酰胺抗菌藥物使其失活，此酶有多種，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)幾種類型：IMP、VIM、SPM、GIM、AIM，其中主要基因型為IMP和VIM［20］。這兩型均有20余種亞型分別由相應(yīng)編碼基因的不同位點(diǎn)發(fā)生突變產(chǎn)生［21］。編碼金屬酶基因位點(diǎn)存在于PA 的質(zhì)?；蛉旧w上。以基因盒存在于整合子之中，大部分的基因位Ⅰ型整合子少數(shù)位于Ⅲ型整合子中，通過質(zhì)粒和整合子的作用，使耐藥性在細(xì)菌間水平傳播。在國(guó)外報(bào)道中，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)MBLs的PA 產(chǎn)生與遺傳因素相關(guān)，說明MBLs的基因擴(kuò)散是由耐藥基因在不同菌種之間的傳遞和克隆引起的［22］。

4.1.2 ESBLs ESBLs編碼基因有多種，包括：TEM 型、SHV型、OXA 型、VEB 型、GES 型、CARB 型、PER 型、CTX 型、LCR 型、BEL型等。其中以TEM 型、OXA 型研究最多。這些主要是由基因位點(diǎn)衍生突變而來，ESBLs的基因大多位于質(zhì)粒和染色體DNA 上，PA 能夠通過轉(zhuǎn)化、傳導(dǎo)、結(jié)合的方式使ESBLs基因在質(zhì)粒和染色體中轉(zhuǎn)移、傳播，并進(jìn)行特異性整合和重組從而引起耐藥產(chǎn)生。ESBLs降低與碳青霉烯類抗菌藥物的親和力，引起青霉素類、氨曲南和碳青霉烯類耐藥。

4.1.3 AmpC酶 AmpC酶屬Bush1群，按Ambler分子結(jié)構(gòu)分類為C類，其優(yōu)先選擇的底物為頭孢菌素類。其表現(xiàn)為對(duì)頭霉素抗菌藥物高度耐藥且不被克拉維酸抑制，但可被氯唑西林抑制。PA 中的AmpC酶分誘導(dǎo)性和非誘導(dǎo)型兩種，正常情況下PA 在沒有誘導(dǎo)劑作用，只有少量AmpC 的產(chǎn)生，但當(dāng)有誘導(dǎo)作用時(shí)，如使用大量三代頭孢菌素后可使其表達(dá)水平大大增加［23］。有研究報(bào)道，在抗菌藥物的誘導(dǎo)和選擇性壓力下，AmpC酶菌株陽性率由實(shí)驗(yàn)開始的20%增長(zhǎng)到90%。從而進(jìn)一步說明了臨床的不合理使用抗菌藥物會(huì)使AmpC 酶菌株廣泛傳播。而產(chǎn)AmpC酶的PA 能水解一至三代頭孢菌素類藥物和頭霉素類藥物，對(duì)大多數(shù)β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥從而使耐藥性更加的突出和嚴(yán)重。在研究PA 對(duì)碳青霉烯類耐藥機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)AmpC酶菌的13株P(guān)A 菌都對(duì)厄他培南耐藥，這表明AmpC的產(chǎn)生也是PA 對(duì)碳青霉烯耐藥的重要機(jī)制［24］。PA 的一些DNA 結(jié)合蛋白如ampR、ampD 及其同源基因，通過與AmpC 誘導(dǎo)的輔因子結(jié)合轉(zhuǎn)化為AmpC 活化因子，從而調(diào)節(jié)AmpC的表達(dá)。但并不是PA 的AmpC 酶的表達(dá)都完全依賴于ampR、ampD 等的染色體突變［25］。

4.2 外膜的通透性障礙 外膜蛋白是許多抗菌藥物進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)的通道。PA 外膜上有許多微孔通道蛋白，如OprC、OprD、OprE，均屬小孔道蛋白。只有部分抗菌藥物能通過。其中外膜孔通道OprD 是一種狹窄的孔道蛋白，是以亞胺培南為代表的碳青霉烯類抗菌藥物進(jìn)入PA 唯一通道［26］。其OprD的基因突變或者缺失造成細(xì)胞外膜對(duì)抗菌藥物通透性下降，抗菌藥物不能通過，是PA 對(duì)亞胺培南等耐藥的重要機(jī)制。如OprD 基因突變，表達(dá)減少或缺失均導(dǎo)致OprD 蛋白減少或缺失，從而阻礙亞胺培南進(jìn)入菌體，是造成PA 對(duì)碳青霉烯類藥物亞胺培南耐藥的主要機(jī)制。OprD2作為亞胺培南特異性通道，OprD2基因缺失也存在缺失突變，編碼區(qū)的一段片段缺失導(dǎo)致移碼的突變，形成新的密碼子從而引起肽鏈異常，導(dǎo)致PA 對(duì)亞胺培南耐藥。PA 的OprD 基因插入IS失活后，基因編碼將會(huì)提前終止，OprD 表達(dá)缺失導(dǎo)致PA 耐藥，同時(shí)OprD同樣也是一些氨基酸及多肽進(jìn)入PA 的通道，與碳青霉烯類競(jìng)爭(zhēng)也會(huì)產(chǎn)生 耐藥［27－28］。

4.3 生物膜的形成 生物膜是細(xì)菌自身分泌的多糖蛋白混合物，具有一定韌性和厚度，具有極強(qiáng)的耐藥性和抵抗免疫系統(tǒng)的作用，對(duì)細(xì)菌發(fā)揮保護(hù)作用。隨著醫(yī)學(xué)材料廣泛應(yīng)用和病房各種置管操作的增多，從而使PA 很容易形成生物膜，導(dǎo)致感染。因?yàn)镻A 的生物膜可分泌胞外多糖，阻礙了抗菌藥物作用于菌體，生物膜具有很強(qiáng)的耐藥性和抗擊機(jī)體免疫系統(tǒng)的作用，不僅使細(xì)菌生命力更持久，而且毒力基因和耐藥基因能力也大大的增加。Hall－Stoodley等［29］的研究表明，生物膜內(nèi)細(xì)菌可分泌β－內(nèi)酰胺酶能水解氨基糖苷類，頭孢類抗菌藥物等抗菌藥物可與膜內(nèi)細(xì)菌的外周多糖相互作用。

4.4 主動(dòng)外排系統(tǒng)的表達(dá) PA 的細(xì)胞膜上具有可以將抗菌藥物排出體外，并與外膜蛋白的缺失突變起協(xié)同作用，從而導(dǎo)致PA 對(duì)多種抗菌藥物耐藥的作用系統(tǒng)，被稱之為細(xì)菌的外排系統(tǒng)。根據(jù)染色體的不同同源性，可將外排系統(tǒng)分為MFS、RNA、ABC、MATE 和SMR，與碳青霉烯抗菌藥物的耐藥有關(guān)，也是最早發(fā)現(xiàn)的RNA 外排家族，而PA 中與細(xì)菌耐藥有關(guān)的是RNA 外排家族［30］。目前在PA 中已有報(bào)道有7種外排泵，包 括MexAB－OprM、MexEF－OprN、MexXY－OprM、Mex－CD－OprJ等7種，其中最常見的是MexAB－OprM 系統(tǒng)［31］。各種外排系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運(yùn)底物不完全相同，其中當(dāng)碳青霉烯類抗菌藥物經(jīng)外膜孔蛋白進(jìn)入膜間隙，在內(nèi)膜外側(cè)中會(huì)被MexB 捕獲，借膜融合蛋白MxeA 的橋聯(lián)作用經(jīng)外膜蛋白OprM 排出菌體外。有研究發(fā)現(xiàn)MexEF－OprN 外排系統(tǒng)表達(dá)上升時(shí)可引起亞胺培南和美羅培南兩者的MIC值都升高，也有研究認(rèn)為Mex－EF－OprN、MexAB－OprM 和MexXY－OprM 外排系統(tǒng)的過度表達(dá)均可引起PA 對(duì)美羅培南的耐藥，而對(duì)亞胺培南的影響不大。因?yàn)镸exAB－OprM 和MexXY－OprM 在菌株中的低水平表達(dá)導(dǎo)致了對(duì)大量抗菌藥物的獲得性耐藥及固有耐藥，其中MexAB－OprM 的過度表達(dá)最為重要，它將進(jìn)入菌體的美羅培南轉(zhuǎn)運(yùn)出胞質(zhì)引起耐藥，是PA 對(duì)美羅培南耐藥的主要機(jī)制而對(duì)IMP影響不明顯［32］。隨著廣譜抗菌藥物的大量使用，能夠通過細(xì)菌的外排泵的底物會(huì)不斷增加，PA 外排系統(tǒng)也會(huì)增加，從而造成它的更嚴(yán)重的耐藥問題。

5 小 結(jié)

PA 感染是目前各級(jí)醫(yī)院中最廣泛、最嚴(yán)重的問題之一，其本身具有對(duì)多種抗菌藥物固有的天然耐藥，又極易產(chǎn)生獲得性耐藥，從而為臨床的治療帶來很大的困難和挑戰(zhàn)。而PA 的耐藥機(jī)制又尤為復(fù)雜，天然耐藥、獲得性耐藥、選擇性耐藥并存。綜上所述，PA 作為臨床常見的分離菌，其耐藥機(jī)制需要更深入的研究，以獲得更有效的手段減少耐藥發(fā)生。合理的使用抗感染藥物，加強(qiáng)對(duì)PA 的監(jiān)測(cè)，采取有效措施控制耐藥菌株出現(xiàn)，及時(shí)切斷多重耐藥菌株的水平傳播，依據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，合理選用抗菌藥物，對(duì)提高抗菌藥物的治療效果尤為重要。

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