20株奇異變形桿菌耐藥基因和整合子分布及親緣關(guān)系分析*

馮福英，楊湘越，洪 宇，鄭宗富，張 薇，蔣際城，曾 琦

（1.中國(guó)人民解放軍第四七六醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建福州 350002；2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)研究所，福建福州 350025）

20株奇異變形桿菌耐藥基因和整合子分布及親緣關(guān)系分析*

馮福英1，楊湘越2，洪 宇1，鄭宗富1，張 薇1，蔣際城1，曾 琦1

（1.中國(guó)人民解放軍第四七六醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建福州 350002；2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)研究所，福建福州 350025）

目的了解該院神經(jīng)內(nèi)科病區(qū)奇異變形桿菌院內(nèi)感染狀況與耐藥機(jī)制。方法對(duì)20株不重復(fù)奇異變形桿菌采用PCR法檢測(cè)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）、頭孢菌素（AmpC）酶、碳青霉烯酶（KPC）和金屬β內(nèi)酰胺酶（MBLs）耐藥基因并測(cè)序；PCR法檢測(cè)整合子并測(cè)序；脈沖場(chǎng)凝膠電泳法分析菌株間親緣關(guān)系；對(duì)這20株奇異變形桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)并分析。結(jié)果從這20株奇異變形桿菌中均檢測(cè)出TEM-1和CTX-M-14型耐藥基因，10株菌中分離出CMY-2型耐藥基因。從19株菌中擴(kuò)增出Ⅰ類整合子，分別整合的基因盒有“aac A4+cml A1”，“dfr A12+orf F+aad A2”和“dfr A32+ere A+aad A2”。脈沖場(chǎng)凝膠電泳結(jié)果聚類分析20株菌可分為P1～P11的11個(gè)PFGE型別，其中P1～P3的12株菌為同一克隆株。20株菌對(duì)美羅培南、阿米卡星、氨曲南、頭孢他啶和哌拉西林/他唑巴坦的敏感率高。結(jié)論該院神經(jīng)內(nèi)科病區(qū)出現(xiàn)奇異變形桿菌同克隆株的傳播；攜帶的耐藥基因以CTX-M-14和CMY-2型為主；Ⅰ類整合子攜帶率高，耐藥基因盒以“aac A4+cml A1”和“dfr A12+orf F+aad A2”為主；菌株對(duì)美羅培南、阿米卡星和氨曲南均為敏感；臨床科室應(yīng)同樣重視由奇異變形桿菌引起的院內(nèi)感染，加強(qiáng)感染控制措施。

奇異變形桿菌； 耐藥基因； 整合子； 脈沖場(chǎng)凝膠電泳

奇異變形桿菌為條件致病菌，也是院內(nèi)感染菌之一。本院2012年12月至2013年2月從神經(jīng)內(nèi)科住院患者臨床標(biāo)本中密集地分離出奇異變形桿菌。為了解本科室住院患者奇異變形桿菌耐藥基因和整合子的分布及它們的親緣關(guān)系，筆者對(duì)20株不重復(fù)菌進(jìn)行了頭孢菌素（AmpC）酶、超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）、碳青霉烯酶（KPC）和金屬β內(nèi)酰胺酶（MBLs）等耐藥基因的擴(kuò)增，進(jìn)行了整合子的檢測(cè)和脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）的分析和藥敏試驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 分離的20株奇異變形桿菌來自神經(jīng)內(nèi)科住院患者標(biāo)本，包括14例痰液、5例尿液、1例胸腔膿液。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定及藥敏試驗(yàn) 采用美國(guó)BD公司PhoenixTM100革蘭陰性桿菌復(fù)合板條（NMIC/ID-4）進(jìn)行菌株鑒定及藥敏試驗(yàn)，依據(jù)CLSI M100-S23版文件的標(biāo)準(zhǔn)判讀藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.2 細(xì)菌基因組模板制備 用OMEGA Bio-Tek公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組抽提試劑盒抽提菌株基因組，基因組樣品終體積為50μL。

1.2.3 質(zhì)粒DNA模板制備 用OMEGA Bio-Tek公司生產(chǎn)的小量質(zhì)粒抽提試劑盒（Plasmid Mini KitⅠ）抽提菌株質(zhì)粒，質(zhì)粒樣品終體積為50μL。

1.2.4 耐藥基因的檢測(cè) 采用PCR法，AmpC酶和ESBLs基因的引物合成和擴(kuò)增條件按文獻(xiàn)［1］進(jìn)行；KPC和MBLs（IMP、VIM、NDM）基因的引物合成和擴(kuò)增條件見表1。采用大連寶生物有限公司的TaKaRa TaqTMHot Start Version試劑盒。

1.2.5 整合子的檢測(cè) 采用PCR法，在整合子的保守序列中設(shè)計(jì)引物5′CS：5′-GGC ATC CAA GCA GCA AG-3′，3′CS：5′-AAG CAG ACT TGA CCT GA-3′。

1.2.6 PCR產(chǎn)物測(cè)序與分析 產(chǎn)物在含0.5 g/mL溴化乙啶的1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，出現(xiàn)目的條帶的判為陽(yáng)性，切膠回收純化；純化產(chǎn)物委托伯尚生物技術(shù)上海有限公司測(cè)序；所測(cè)序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)以確定基因型。

1.2.7 PFGE 用限制性內(nèi)切酶SfiⅠ（NEB公司產(chǎn)品）進(jìn)行酶切。實(shí)驗(yàn)方案參照美國(guó)病原菌分子分型監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)Pulse Net標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行；用Bionumerics軟件Cluster analysis模塊進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1 耐藥基因檢測(cè) 20株菌中均檢測(cè)到β-內(nèi)酰胺酶的TEM-1型和ESBLs的CTX-M-14型基因，從10株菌中檢測(cè)到AmpC酶的CMY-2型基因；未檢測(cè)到SHV型、KPC和MBLs（IMP、VIM、NDM）基因；部分PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1、2。圖

2.2 整合子檢測(cè) 19株菌檢測(cè)到Ⅰ類整合子；17株菌擴(kuò)增出的二個(gè)可變區(qū)中，2 256 bp大小的可變區(qū)內(nèi)含“aac A4+ cml A1”基因盒，1 864 bp大小的可變區(qū)內(nèi)含“dfr A12+orf F+ aad A2”基因盒；2株菌擴(kuò)增出3 002 bp的可變區(qū)，內(nèi)含“dfr A32 +ereA+aad A2”基因盒；1株菌未擴(kuò)增出整合子；部分整合子PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖3。

2.3 藥物試驗(yàn) 20株分離菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.4 PFGE及聚類分析 20株菌PFGE后，可見8～14條大小不一的電泳條帶。聚類分析顯示，菌株間條帶相似度為47.013%～100.000%之間；按照100%的相似度可將菌株酶切圖譜分為11種型別（PFGE type），記為P1～P11，大部分型別只有1個(gè)菌株，P1型包含10個(gè)株菌。PFGE聚類分析結(jié)果見圖4（見《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”）。

3 討 論

分析的20株奇異變形桿菌均為產(chǎn)ESBLs菌株，ESBLs的檢出率明顯高于文獻(xiàn)［2-3］報(bào)道的16.1%和10.7%，20株菌攜帶的耐藥基因型均為CTX-M-14，與文獻(xiàn)［2］報(bào)道的以CTXM-15基因型為主的結(jié)果略有差異，但均為CTX-M型耐藥基因；從10株菌中擴(kuò)增出AmpC酶CMY-2型基因，50%的檢出率明顯高于文獻(xiàn)［4-5］報(bào)道的1.4%和0.1%，基因型與文獻(xiàn)［4-6］報(bào)道的基因型相同；20株菌中10株菌同時(shí)產(chǎn)ESBLs和AmpC酶，產(chǎn)超超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（SSBL）菌的陽(yáng)性率為50%。本院檢出的奇異變形桿菌的ESBLs基因型以CTX-M型為主，AmpC酶的基因型以CMY型為主。

整合子是細(xì)菌中的一種可移動(dòng)性基因元件，在耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移中起到了至關(guān)重要的作用。分析的20株奇異變形桿菌中19株擴(kuò)增出Ⅰ類整合子，陽(yáng)性率（95%）明顯高于文獻(xiàn)［7］38.6%的報(bào)道。整合的耐藥基因產(chǎn)物可導(dǎo)致奇異變形桿菌對(duì)氯霉素、三甲氧芐啶、紅霉素、鏈霉素和壯觀霉素的耐藥。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果提示美羅培南、阿米卡星、氨曲南、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦和頭孢他啶可作為對(duì)奇異變形桿菌感染治療的首選用藥或經(jīng)驗(yàn)用藥。16株菌對(duì)亞胺培南耐藥，與文獻(xiàn)［8］報(bào)道的主要因產(chǎn)碳青霉烯酶所致耐藥的原因不同，均未檢出碳青霉烯酶和金屬酶，可能與其他機(jī)制有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

按80%的相似度為標(biāo)準(zhǔn)［9］，PFGE聚類分析中的三個(gè)PFGE型別的1～12號(hào)菌株判為同一菌株來源；通過臨床調(diào)查，分離出奇異變形桿菌的這些病患均有住過該病區(qū)ICU病房的經(jīng)歷，而該ICU病房因危重患者多，床位之間的距離未達(dá)到一米以上的要求，加之可能的其他感染控制措施的不到位，造成了此次奇異變形桿菌的院內(nèi)感染。

此次研究結(jié)果揭示本院神經(jīng)內(nèi)科病區(qū)出現(xiàn)奇異變形桿菌的院內(nèi)感染；均為產(chǎn)ESBLs株，其中SSBL菌占50%，攜帶的耐藥基因型為CTX-M-14和CMY-2；Ⅰ類整合子的攜帶率高達(dá)95%；美羅培南、氨曲南、阿米卡星、頭孢他啶和加酶抑制劑的抗菌藥物可作為首選用藥或經(jīng)驗(yàn)用藥；本院分離的耐亞胺培南株與KPC和MBLs無(wú)關(guān)；臨床科室應(yīng)加強(qiáng)院內(nèi)感染控制措施的落實(shí)，避免或減少院內(nèi)感染的發(fā)生。

［1］ 馮福英，胡望平，楊湘越，等.耐頭孢西丁革蘭陰性桿菌高產(chǎn)AmPC酶發(fā)生率及基因型與耐藥性研究［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2006，16（6）：601-604.

［2］ 范建中，董曉勤，王賢軍.奇異變形桿菌耐藥性和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因型研究［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2012，22（2）：378-379.

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Study on distribution of drug resistance gene and integron and analysis of genetic relationship of 20 isolates of Proteus mirabilis*

Feng Fuying1，Yang Xiangyue2，Hong Yu1，Zheng Zongfu1，Zhang Wei1，Jiang Jicheng1，Zeng Qi1

（1.Department of Clinical Laboratory，the 476th Hospital of PLA，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 35002，China；2.Institute of Laboratory Medicine，F(xiàn)uzhou General Hospital of Nanjing Military Command，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350025，China）

ObjectiveTo investigate the prevalence and resistance mechanisms of Proteus mirabilis in the ward of neurology department of our hospital.MethodsFor a total of 20 clinic isolates of Proteus mirabilis，PCR were used for the detection of AmpC，ESBLs，KPC and MBLs and then DNA sequencing was performed.The integrons were also detected by using PCR and then sequencing was carried out.The genetic relationship between isolates were detected and analysed by pulsed-field gel electrophoresis（PFGE）.The results of drug sensitivity tests were analysed.ResultsTEM-1 and CTX-M-14 gene were found in all the 20 isolates，the 10 isolates of Proteus mirabilis were also found carrying CMY-2 gene.ClassⅠintegrons were amplified from 19 strains carrying gene cassettes″aac A4+cml A1″，″dfr A12+orf F+aad A2″and″dfr A32+ere A+aad A2″respectively.PFGE analysis revealed that the 20 isolates were grouped into 11 PFGE types P1-P11，the 12 isolates of P1-P3 were same clones.The sensitive rates of the isolates to Meropenem，Amikacin，Aztreonam，Ceftazidime and Tazocin were high.ConclusionNosocomial transmission of the same clone of Proteus mirabilis was appeared in the ward of neurology department of our hospital.The predominance drug-resistance genes were CTX-M-14 andCMY-2.The incidence of carrying classⅠintegrons was high，and the major gene cassettes were″aac A4 +cml A1″and″dfr A12+orf F+aad A2″.The 20 isolates were all sensitive to Meropenem，Amikacin and Aztreonam.Other Clinical departments should also pay attention to the nosocomial infection caused by Proteus mirabilis and strengthen the infection control measures.

Proteus mirabilis； drug resistance gene； integron； pulsed-field gel electrophoresis

10.3969/j.issn.1673-4130.2015.17.003

A

1673-4130（2015）17-2461-03

2015-04-14）

南京軍區(qū)醫(yī)藥衛(wèi)生科研項(xiàng)目（11 MA118）；南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（06MA149）。 作者簡(jiǎn)介：馮福英，女，副主任醫(yī)師，主要從事臨床微生物學(xué)與檢驗(yàn)的研究。