加熱法預(yù)防快速冷凍切片脫片的應(yīng)用體會(huì)

吳王飛　陳迅　程雪　張靜敏　紀(jì)捷　李青

摘要：目的 探討如何提高快速冷凍切片質(zhì)量的技術(shù)和方法，防止快速冷凍切片脫片，提高快速冷凍切片的速度。方法 每日隨機(jī)選取術(shù)中送檢快速冷凍的新鮮標(biāo)本，同一標(biāo)本取兩塊相近組織，其中一塊使用傳統(tǒng)常溫的快速冰凍切片方法進(jìn)行制片，另一塊使用自我摸索的載玻片加熱"新方法"進(jìn)行制片。然后將兩種方法對(duì)照，并分別觀察兩組冷凍制片染色后的效果。結(jié)果 "加熱組"的快速冷凍制片中只出現(xiàn)一例子宮肌瘤脫片，脫片發(fā)生率僅為0.2%。而"常溫組"中卻有26例發(fā)生不同程度掉片，脫片發(fā)生率為5.2%，且以子宮肌瘤和宮頸組織的脫片發(fā)生率最高。結(jié)論 使用載玻片加熱的"新方法"進(jìn)行快速冷凍切片能很好地防止組織脫片，可以有效縮短快速冷凍的制片時(shí)間。

關(guān)鍵詞：快速冷凍切片；脫片；加熱；速度；質(zhì)量分析

在快速冷凍切片中，時(shí)間是快速冷凍切片的關(guān)鍵[1]。有些組織在制片過程中會(huì)發(fā)生脫片，再次切片必然會(huì)延緩快速冷凍切片速度，不能為診斷醫(yī)生提供相對(duì)充裕的診斷報(bào)告時(shí)間。為此，我們嘗試了一種新的快速冷凍制片方法（簡(jiǎn)稱"新方法"）進(jìn)行不斷嘗試，旨在證明其是否真的可以防止快速冷凍切片的組織脫片。

1資料與方法

1.1一般資料 收集南京市婦幼保健院病理科快速冷凍送檢的新鮮標(biāo)本500例，每例取兩塊部位相近、厚薄一致且大小相似的組織。隨機(jī)分為兩組：其中一塊組織使用傳統(tǒng)規(guī)范的快速冷凍方法進(jìn)行制片，另一塊組織使用"新方法"進(jìn)行快速冷凍切片。

1.2儀器 制片所用機(jī)器型號(hào)為德國萊卡CM1900冰凍切片機(jī)及其配套的組織托、OCT包埋劑、一次性刀片和甲醇固定液。

1.3方法

1.3.1常溫組 這是傳統(tǒng)方法。將待切組織塊切面朝上，放在組織托中央，OCT包埋劑包埋，待組織塊冷凍變硬后切片，常溫下載玻片寫上編號(hào)，然后進(jìn)行貼片。載玻片貼片后立即放入固定液中固定，固定時(shí)間為10～15 s；水洗；蘇木素2 min；水洗；鹽酸酒精分化1 s；水洗；溫水藍(lán)化；伊紅5～10 s；最后梯度酒精脫水、二甲苯透明及中性樹膠封固。

1.3.2加熱組 我們稱其為"新方法"。將組織托放在流水下沖洗幾秒鐘，甩去多余的水，待切組織塊切面朝上，放在組織托中央，OCT包埋劑包埋，待組織塊冷凍變硬后切片。同時(shí)將載玻片寫上編號(hào)放入恒溫干燥箱（溫度設(shè)置在65℃～75℃間）中加熱約1 min，取出后在室溫中稍加冷卻即可貼片。貼片后的處理同傳統(tǒng)常溫組。

1.3.3切片評(píng)價(jià) 將兩組切片交由兩位不了解分組信息的病理醫(yī)生鏡下觀察，然后按照江蘇省診斷和技術(shù)規(guī)范對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2結(jié)果

通過將載玻片加熱的"新方法"制作的快速冰凍切片，我們觀察發(fā)現(xiàn)在具體切片環(huán)節(jié)與常溫組無明顯差異。經(jīng)快速冷凍切片染色后，鏡下觀察細(xì)胞漿呈淡紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，核漿對(duì)比分明，色澤鮮艷，無皺褶，組織結(jié)構(gòu)清晰，層次分明。其質(zhì)量與常溫組冷凍切片相比不相上下，甚至在某些方面勝過常溫組制片質(zhì)量。更重要的是，"新方法"中快速冷凍切片組織幾乎不出現(xiàn)脫片，基本不需要重新制片，有效地提高了快速冷凍的切片時(shí)間和切片質(zhì)量，見圖1～6。由圖可見，宮頸、軟骨及乳腺脂肪組織在快速冷凍切片常規(guī)制作中很容易發(fā)生脫片，而我們的新方法"加熱組"中則能使切片保持較好的完整性。如表1所示，我們分別選取了婦產(chǎn)科常見的幾種不同瘤體組織，具體包括乳腺、子宮肌瘤/腺肌瘤、卵巢腫瘤、子宮內(nèi)膜及宮頸疾病組織。"新方法"的快速冷凍制片中只出現(xiàn)一例子宮肌瘤脫片，脫片發(fā)生率僅為0.2%。而常溫組中卻有26例發(fā)生不同程度脫片掉片，脫片發(fā)生率為5.2%。其中，子宮肌瘤和宮頸組織在傳統(tǒng)常溫冷凍制片中的脫片發(fā)生率最高，見表1。"加熱組"的脫片發(fā)生率與"常溫組"相比有很大差異，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05；χ2=23.790，P=0.000）。

3討論

3.1快速冷凍切片的基本條件及注意事項(xiàng)[10]

3.1.1要做好準(zhǔn)備工作。首先刀要鋒利，一次性刀片要定時(shí)更換。要保證冷凍切片機(jī)24h處于備用狀態(tài)，預(yù)定好冷凍溫度和除霜時(shí)間。

3.1.2在恒溫干燥箱中烤切片，時(shí)間不能過長，以不超過1min為宜，否則會(huì)使組織干燥而影響染色。

3.1.3切片手法要熟練，技術(shù)員要熟練掌握機(jī)器性能和冷凍切片方法，熟練掌握不同組織的適宜溫度和其他相關(guān)條件，只有不斷實(shí)踐才能逐步積累經(jīng)驗(yàn)。

3.1.4冷凍切片通常比石蠟切片厚，細(xì)胞由于未固定往往偏大。在制片過程中要根據(jù)不同的組織調(diào)節(jié)不同的溫度，有時(shí)溫度過低會(huì)使組織過脆、切片撕裂；帶有脂肪的組織往往不易成片而引起折疊，有時(shí)染色不佳影響觀察，或冷凍過度時(shí)細(xì)胞內(nèi)會(huì)出現(xiàn)冰晶現(xiàn)象。

3.1.5術(shù)中冷凍切片快速診斷，要求病理醫(yī)師準(zhǔn)確取材，不要僅限1塊，應(yīng)取2～3塊為最佳，并要求技術(shù)員要認(rèn)真仔細(xì)觀察不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)才能制作良好切片，保證冷凍診斷質(zhì)量。

3.2影響組織切片脫片的因素

3.2.1載玻片不干凈 載玻片一定要干凈，如果載玻片不干凈，可能導(dǎo)致脫片或者影響鏡下觀察[8]。一般不建議用防脫玻片，防脫玻片上面的粘附劑會(huì)與后面染色試劑發(fā)生反應(yīng)，從而影響鏡下觀察。最好直接使用常規(guī)載玻片預(yù)熱的方法對(duì)組織進(jìn)行快速冷凍切片，此方法簡(jiǎn)單，制作時(shí)間短，切片質(zhì)量好，術(shù)后診斷符合率98%以上，與常規(guī)HE切片染色無明顯差別。

3.2.2溫度 快速冷凍切片是利用組織切片和載玻片的溫度差將組織切片貼附到載玻片上，適當(dāng)增加兩者的溫度差可以減少組織脫片。

3.2.3切片太厚 調(diào)好切片的厚度，以4～6 μm為宜。

3.2.4固定液濃度過低 定期更換固定液，保證固定液的濃度。

3.2.5組織內(nèi)含過多的壞死和脂肪組織 避免過多的壞死和脂肪組織[6]，延長固定時(shí)間，用酒精燈適當(dāng)烤一烤，增加組織與玻片的粘貼。

決定快速冷凍切片是否脫片的因素很多[3]，除了以上所述，組織托與組織之間的粘合度以及裱片是其中的兩個(gè)關(guān)鍵因素。我們的"新方法"中將組織托先浸水然后再放置組織于其上，正是為了增加組織托與組織之間的粘附力從而達(dá)到了組織穩(wěn)定的效果。冷凍快速切片的裱片是利用載玻片和組織切片間的溫度差，將切出的片子貼附在載玻片上，然后進(jìn)行固定染色。尤其在寒冷的冬天，室內(nèi)溫度較低，加之組織切片過厚，往往組織切片與載玻片粘附不牢固，適當(dāng)?shù)慕o載玻片加溫，使切片與載玻片緊密地粘附在一起[9]，從而大大減少了脫片的發(fā)生率。

快速冷凍切片脫片是快速制片過程中經(jīng)常面臨的一個(gè)技術(shù)挑戰(zhàn)，尤其是對(duì)我們婦產(chǎn)科醫(yī)院病理科的技術(shù)員更是如此[2]。婦產(chǎn)科病理冷凍制片中最常遇見的是子宮肌瘤/肌腺瘤及宮頸這樣的偏硬組織，冷凍制片過程中較易發(fā)生脫片現(xiàn)象。除此之外，乳腺組織若脂肪較多時(shí)也很容易發(fā)生脫片。如何防止脫片從而提高快速冷凍制片效率是我們技術(shù)組一直追求的目標(biāo)之一。

綜上所述，在快速冷凍診斷中，時(shí)間是快速冷凍切片的關(guān)鍵[4]。我們探索的"新方法"通過實(shí)踐檢驗(yàn)，證明確實(shí)能夠有效地降低了快速冷凍切片的脫片概率，不僅節(jié)約了制片時(shí)間，同時(shí)也提高了切片質(zhì)量。為快速病理診斷提供了更好的技術(shù)支持，也為診斷醫(yī)生提供了更充裕的判讀時(shí)間，值得推薦。

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[10]馬恒輝，周曉軍.如何提高冷凍切片的技術(shù)水平[J].臨床與試驗(yàn)病理學(xué)雜志，2011，27（1）： 90-92.編輯/申磊