櫻桃谷肉鴨H5N1亞型禽流感（Re—6株）滅活疫苗母源抗體消長規(guī)律及免疫程序研究

劉琨

摘要：選取1日齡健康無免疫的櫻桃谷肉鴨480羽，隨機分成A、B、C、D 4組，每組120羽。B、C和D組在10日齡分別免疫H5N1亞型禽流感（Re-6株）滅活疫苗0.5、0.8和1.0 mL/羽，A組為非免疫對照組。用HI方法檢測其母源抗體和免疫抗體，根據(jù)母源抗體和免疫抗體消長規(guī)律，探討櫻桃谷鴨H5N1亞型禽流感（Re-6株）滅活疫苗的合理免疫程序。結(jié)果表明，櫻桃谷鴨母源抗體效價和抗體合格率在1日齡最高，分別為6.6 log2和96.7%，14日齡下降至3.87 log2和56.7%，21日齡之后幾乎沒有保護力;3個試驗組免疫抗體水平和抗體合格率在統(tǒng)計學(xué)上差異不顯著（P>0.05），建議免疫程序為：10日齡免疫，免疫劑量0.8 mL/羽。

關(guān)鍵詞：H5N1高致病性禽流感;母源抗體;免疫程序;血凝抑制試驗;HI抗體效價;抗體合格率

中圖分類號：S859.79+7 ? ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2015）02-0402-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.036

Maternal Antibody Changes and Immune Procedure of H5N1 Subtype AI （Re-6 Strain） Inactivated Vaccine for Cherry Valley Meat Duck

LIU Kun

（Xinyang Animal Disease Control and Prevention Center， Xinyang ?464000， Henan， China）

Abstract： 480 one-day-old healthy non-immune Cherry Valley meat ducks were selected and randomly divided into four groups including A， B， C and D， and immunized with 0.0， 0.5， 0.8 and 1.0 mL H5N1 subtype AI （Re-6 strain） inactivated vaccine at 10 days old. Maternal antibody and immune antibody were examined with HI test. Based on their changes， rational immune procedure of H5N1 subtype AI （Re-6 strain） inactivated vaccine was established. The results showed that the titer of maternal antibody and the qualified rate of antibody tended to be highest at 1 days old， with 6.6 log2 and 96.7%. At 14 days old， the indexes declined to 3.87 log2 and 56.7%. After 21 days old， the titer declined to nearly 0 log2. The levels and qualified rates of immune antibody in 3 groups showed no significant difference （P>0.05）. It is indicated that the immune procedure might be ?at 10 days old with 0.8 mL.

Key words：H5N1 pathogenic avian influenza; maternal antibody; immune procedure; hemagglutination inhibition; HI antibody titer; antibody qualified rate

河南信陽地區(qū)河網(wǎng)密布，非常適合鴨鵝等水禽的養(yǎng)殖。近年來，信陽地區(qū)養(yǎng)鴨業(yè)呈持續(xù)迅猛發(fā)展的態(tài)勢，其飼養(yǎng)量和存欄量連年增長。肉鴨因其飼養(yǎng)周期短、成本低、出欄早，養(yǎng)殖規(guī)模在信陽市各縣（區(qū)）逐步擴大。目前，全市肉鴨存欄量已達1 800萬只，年出欄5 000萬只，均居河南省首位。

隨著肉鴨養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，鴨病尤其是鴨病毒性疾病（鴨瘟、鴨病毒性肝炎、鴨副黏病毒病等）的流行日趨嚴(yán)重，特別是禽流行性感冒對肉鴨養(yǎng)殖業(yè)的打擊甚至是毀滅性的。禽流行性感冒簡稱禽流感（Avian influenza，AI），是由禽流感病毒引起的傳染病。AIV根據(jù)其對家禽致病力的不同分為3種，即高致病性、低致病性和無致病性。H5N1高致病性禽流感病毒（HPAIV）是嚴(yán)重危害禽類的病原之一，并且對人類健康威脅較大[1]，該亞型禽流感病毒是目前發(fā)現(xiàn)的禽流感病毒中感染性最強、致死率最高、流行最廣的一類病毒，已在世界上多個國家發(fā)生流行，給禽類養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[2]。近年來，H5N1亞型禽流感流行出現(xiàn)新特點：感染對象種類不斷增多，宿主范圍不斷擴大，水禽不僅能感染，還能引起大量死亡。因此，預(yù)防和控制水禽的H5N1禽流感感染具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義?，F(xiàn)階段，預(yù)防肉鴨禽流感病毒感染主要依靠給肉鴨接種H5N1亞型禽流感滅活疫苗。根據(jù)農(nóng)業(yè)部及河南省畜牧局的要求，信陽地區(qū)從2012年5月份開始，水禽使用H5N1亞型禽流感（Re-6）滅活株疫苗進行防疫，養(yǎng)殖戶在其飼養(yǎng)周期內(nèi)何時免疫高致病性禽流感疫苗、劑量多少，國內(nèi)尚未見相關(guān)的試驗數(shù)據(jù)及合理的免疫程序報道。為探討重組禽流感病毒滅活疫苗（H5NI亞型，Re-6株）對肉鴨的免疫效果，根據(jù)國家強制免疫計劃及相關(guān)研究[3，4]，本試驗選用相同日齡櫻桃谷肉鴨采用不同劑量疫苗對其進行免疫接種并監(jiān)測其抗體消長規(guī)律，以制定出合理的免疫程序，為預(yù)防和控制肉鴨禽流感提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗時間

試驗時間為2013年9～12月。

1.2 ?試驗用疫苗

重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-6株）由遼寧益康生物股份有限公司提供，批號：20130801。

1.3 ?檢測試劑及儀器設(shè)備

1.3.1 ?檢測試劑 ?禽流感H5亞型（Re-6株）血凝抑制試驗診斷抗原（批號：2013005）和禽流感H5亞型（Re-6株）陰、陽性血清（批號：2013004）。

1.3.2 ?1%雞紅細胞懸液 ?采集2～3羽無禽流感和新城疫等抗體的健康公雞血液自行配制。

1.3.3 ?儀器設(shè)備 ?Eppendorf 10～1 000 μL單道移液器及25～300 μL多道移液器（德國Eppendorf公司）;303系列電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海樹立儀器儀表有限公司）;TDZ5-WS型臺式低速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）。

1.4 ?試驗動物及分組

1日齡健康無免疫的櫻桃谷肉鴨480羽，潢川縣華英集團某飼養(yǎng)場專人飼養(yǎng)。將雛鴨隨機分成A、B、C、D 4組，每組120羽，A組為非免疫對照組，其余各組均為試驗組。B、C和D組在10日齡分別免疫重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-6株）0.5、0.8、1.0 mL/羽。

1.5 ?試驗方法

1.5.1 ?采樣 ?各組分別在1、7、14、21、28、35、42日齡時隨機抽取30羽翅靜脈采血，每羽1～2 mL，分離血清后冷凍保存?zhèn)錂z。

1.5.2 ?檢測 ?禽流感抗體檢測采用血凝試驗（HA）及血凝抑制試驗（HI），具體方法按照《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/T18936-2003）進行。

判定標(biāo)準(zhǔn)：以完全抑制4單位抗原的最高血清稀釋倍數(shù)判為該血清的HI效價。當(dāng)陽性對照血清的HI效價與被檢血清HI效價誤差不超過1個滴度，陰性對照血清的HI效價不高于2log2時，試驗方可成立。被檢血清HI效價≤3log2判為陰性;HI效價≥4log2判為陽性;3log2

1.6 ?數(shù)據(jù)處理

HI效價采用算術(shù)平均數(shù)表示，群體免疫合格情況即抗體合格率，抗體合格率=合格抗體數(shù)/檢測數(shù)×100%，群體免疫抗體陽性率達到70%判定為群體合格。不同試驗組檢測結(jié)果采用One-way ANOVA分析差異顯著性，P<0.05時差異顯著，P<0.01時差異極顯著。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同日齡櫻桃谷肉鴨H5N1亞型禽流感（Re-6株）滅活疫苗母源抗體檢測情況

由圖1可見，雛鴨母源抗體效價在1日齡最高，平均值達到6.6 log2，有較好的保護力;隨著日齡增長，母源抗體開始下降，至14日齡，HI效價平均值為3.87 log2，保護作用大大降低;至28日齡，鴨群基本無母源抗體，已起不到保護作用。

2.2 ?不同日齡櫻桃谷肉鴨H5N1亞型禽流感（Re-6株）滅活疫苗保護性母源抗體群體合格率情況

由圖2可見，雛鴨在1日齡時，母源抗體群體合格率為96.7%;至7日齡時，還有90%的個體達到保護要求;至14日齡時，檢測的30只雛鴨中有13只抗體效價在4log2以下，抗體合格率已經(jīng)下降至56.7%;至21日齡時僅有2只鴨抗體效價在4log2以上，其合格率僅為6.7%;28日齡以后，整個鴨群無有效禽流感保護性抗體。

2.3 ?試驗組不同日齡櫻桃谷鴨H5N1亞型禽流感（Re-6株）滅活疫苗免疫抗體消長情況

由圖3和圖4可見，B、C和D組HI效價均值及抗體合格率均是在14日齡達到最低值，此后逐漸上升。對B、C和D組的HI效價均值進行生物統(tǒng)計分析，差異不顯著（P>0.05）;對B、C和D組的抗體合格率進行生物統(tǒng)計分析，差異也不顯著（P>0.05）?？傮w而言，以C組稍好。

3 ?小結(jié)與討論

3.1 ?櫻桃谷肉鴨H5N1亞型禽流感（Re-6株）滅活疫苗母源抗體消長規(guī)律

有研究表明，種鴨產(chǎn)生的免疫抗體可以通過卵黃傳遞給雛鴨，起到天然被動免疫的作用，保護雛鴨抵抗禽流感病毒的侵襲[5]。HI效價≥4log2時，可以保護鴨體免受禽流感野毒感染。本試驗通過對不同日齡的櫻桃谷肉鴨母源抗體消長變化的觀察發(fā)現(xiàn)，在7日齡之前，鴨群中90%以上的個體HI效價在4log2及以上，獲得的母源抗體可以有效保護鴨群;至14日齡時，HI效價均值僅為3.87log2，鴨群僅有56.7%的個體有保護性抗體;雛鴨在21日齡還能夠檢測到極低的母源抗體，鴨群中6.7%的個體還有一定的保護力;28日齡之后，鴨群所有個體的HI效價均在4log2以下，鴨群已經(jīng)喪失對禽流感病毒的抵抗力。

3.2 ?櫻桃谷肉鴨H5N1亞型禽流感（Re-6株）滅活疫苗免疫程序

重組禽流感病毒滅活疫苗（H5NI亞型，Re-6株）是農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局根據(jù)病毒流行病學(xué)監(jiān)測情況和疫苗評估結(jié)果以及專家評審意見授權(quán)疫苗廠家生產(chǎn)的用于防控水禽禽流感的產(chǎn)品[6]，目前國內(nèi)還未見該疫苗免疫水禽的試驗研究報告。一般認為，家禽日齡和品種不同，對疫苗免疫的敏感性也不一致，HI抗體產(chǎn)生的時間和所能達到的高度及維持的時間也存在差別[7]。鴨的高致病性禽流感免疫一般需要二次免疫才能得到較高的免疫抗體[8]。由于櫻桃谷肉鴨飼養(yǎng)周期短，45 d就出欄，免疫時機和劑量的選擇就顯得尤為重要。本研究中，根據(jù)國家免疫計劃要求免疫的時間段和相關(guān)研究，選在10日齡，對櫻桃谷肉鴨進行了3個劑量H5N1亞型禽流感（Re-6株）滅活疫苗免疫程序的研究。3個試驗組的HI效價均值在試驗期間均在4 log2以上，0.8和1.0 mL組的抗體合格率均在70%以上。綜合來看，在10日齡對櫻桃谷肉鴨注射0.8 mL/羽H5N1亞型禽流感（Re-6株）滅活疫苗是比較合理的免疫程序。

3.3 ?討論

禽流感對鴨群危害極大，一旦發(fā)病，會給養(yǎng)殖場（戶）帶來巨大的損失，所以對該病的防疫就顯得尤為重要，為提高禽流感疫苗對櫻桃谷肉鴨的免疫效果，建議采取如下措施：①疫苗的免疫接種要嚴(yán)格按照說明書進行，免疫注射時要輕逮輕放。②提高禽群的免疫力和抗應(yīng)激能力。在免疫前后，給禽群的飲水或飼料中添加黃芪多糖、植物血凝素和蜂靈散等免疫促進劑促進鴨群的免疫應(yīng)答[9]，添加適量的電解多維等營養(yǎng)性藥物以提高其抗應(yīng)激能力。③要加強對防疫人員的培訓(xùn)，確保免疫效果和免疫密度。

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