pH梯度法制備維生素C脂質體

劉力銘，頊興敏

（青島科技大學化工學院，山東青島 266042）

pH梯度法制備維生素C脂質體

劉力銘，頊興敏

（青島科技大學化工學院，山東青島 266042）

制備維生素C脂質體，并考察其包封率的影響因素。采用pH梯度法制備維生素C脂質體，以紫外分光光度法和粒度儀分別測定脂質體的包封率和粒徑，并考察外水相pH、超聲時間、載藥溫度及藥脂比對包封率的影響。結果顯示包封率隨外水相pH的降低而增加，最佳超聲時間為15 min，隨著載藥溫度的增加包封率有提高的趨勢，最佳藥脂比為1∶5。該條件下pH梯度法制備的維生素C脂質體的包封率為（49.79±1.6）%（n=3），平均粒徑為（118.3±9.6）nm。

維生素C；脂質體；pH梯度法；包封率

脂質體（liposome）是一種人工膜。在水中磷脂分子親水頭部插入水中，脂質體疏水尾部伸向空氣，攪動后形成雙層脂分子的球形脂質體，直徑25～1000 nm不等。脂質體可用于轉基因，或制備的藥物，利用脂質體可以和細胞膜融合的特點，將藥物送入細胞內(nèi)部。生物學定義：當兩性分子如磷脂和鞘脂分散于水相時，分子的疏水尾部傾向于聚集在一起，避開水相，而親水頭部暴露在水相，形成具有雙分子層結構的的封閉囊泡，稱為脂質體。藥劑學定義：系指將藥物包封于類脂質雙分子層內(nèi)而形成的微型泡囊體。

維生素C（Vitamin C），又名抗壞血酸，廣泛應用于化妝品和保健品中，具有良好的美白祛斑、延緩衰老的美容功效，近年來更發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗癌性能。維生素C作為水溶性維生素，在人體內(nèi)不能儲存，必須每天補充。其水溶液極不穩(wěn)定且不易透過皮膚，所以維生素C的使用受到極大的限制[1]。將維生素C做成脂質體溶液，不僅可以極大的提高穩(wěn)定性，且能使之更容易的透過皮膚，應用前景廣闊[2]。

本實驗選用大豆卵磷脂和膽固醇作為膜材，采用pH梯度法制備維生素C脂質體。主要目的是以平均粒徑和包封率為指標，優(yōu)化制備脂質體的工藝和處方，從而制備包封率高、粒徑均一、穩(wěn)定性好的維生素C脂質體。

1 儀器與試劑

UV1000紫外分光光度計（北京萊伯泰科有限公司）；IT-09A5型恒溫磁力攪拌器（上海一恒科學儀器有限公司）；Zetasizer Nano ZS90納米粒度和Zeta電位及分子量分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）；KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；YP-202N電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；高速離心機（上海安亭科學儀器廠）。

維生素C（天津鑫鑫制藥廠，含量99%）；大豆卵磷脂（化學純，天津市博迪化工股份有限公司）；膽固醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；維生素E（鄭州荔諾生物科技有限公司，含量98%）；氯仿（分析純，煙臺三和化學試劑有限公司）；甲醇（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；氫氧化鈉（分析純，天津市博迪化工股份有限公司）；磷酸二氫鉀（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；磷酸二氫鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；磷酸氫二鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 脂質體的制備

精密稱取處方量大豆卵磷脂、膽固醇和維生素E放置于燒杯中，加入適量氯仿，將燒杯放置于恒溫磁力攪拌器上，常溫下攪拌至完全溶解。將溶液轉移至圓底燒瓶中，加入磷酸鹽緩沖液，超聲得乳白色溶液。將乳白色溶液在旋轉蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)，直至氯仿完全揮發(fā)，燒瓶內(nèi)壁出現(xiàn)透明薄膜。燒瓶中加入含有維生素C的磷酸鹽緩沖液（含有焦亞硫酸鈉和依地酸二鈉）使膜充分水化，孵育一定時間后生成乳白色半透明溶液。所得半透明溶液分別過0.45 μm和0.22 μm微孔濾膜各3次，即得維生素C脂質體[3]。

2.2 標準曲線繪制

精密稱取5.1 mg維生素C置于100 mL容量瓶中，加入pH 5.0的硫酸溶液，振搖、溶解、定容。分別移取1、1.5、2、3、3.5、4和5 mL于25 mL容量瓶中，加硫酸溶液定容、搖勻，在266 nm處測吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，進行線性回歸即得標準曲線方程：y=0.1129x-0.0861，R2=0.9995。結果表明維生素C在2.04～10.20 μg/ mL內(nèi)線性關系良好[4]。

2.3 回收率實驗

分別取處方量維生素C藥物的80%、100%、120%，分別加入適量空白脂質體溶液。搖勻后，用甲醇破膜，用pH 5.0的硫酸溶液定容。測定維生素C的紫外吸收，計算得回收率分別為（99.3± 1.9）%、（101.6±2.8）%、（103.5±3.6）%（n=3）。結果表明，制備脂質體的輔料對樣品測定沒有影響，且方法簡便、重現(xiàn)性好[5]。

2.4 包封率測定

取一定量維生素C脂質體溶液置于高速離心機中。在轉速為12000 r/min下，每次離心5 min，共3次，離心后，分別取上清液和被甲醇破乳的沉淀物進行紫外測定計算出藥物含量，其中上清液中是未包封的藥物，沉淀物中是被包封的藥物，根據(jù)公式：包封率=包封藥物量/（包封藥物量+未包封藥物量）×100%，計算得出包封率。

2.5 正交試驗設計

以藥脂比（A）、超聲時間（B）、外水相pH（C）和載藥溫度（D）為考察因素，根據(jù)單因素實驗的結果選取恰當?shù)乃剑肔9（34）正交試驗法優(yōu)化工藝處方，結果見表1和表2。

表1 正交試驗因素及水平

表2 正交實驗結果

通過對正交實驗進行極差分析可知，各因素對包封率影響的順序為B＞C＞D＞A。分析得出最優(yōu)化組合為A1B3C3D3。

2.6 驗證實驗

以篩選出的最優(yōu)化條件制備脂質體，重復3次，得到脂質體的平均包封率為（49.79±1.6）%，平均粒徑為（118.3±9.6）nm，平均Zeta電位為（-39.9±2.1）mV。納米粒度分布圖、Zeta電位分布圖如下：

圖1 納米粒度分布圖

圖2 Zeta電位分布圖

3 討論

膜材中加入少量維生素E可有效地抑制磷脂的氧化速度，提高脂質體的穩(wěn)定性。

維生素C在空氣中極易被氧化，因此處方中需要加入焦亞硫酸鈉和依地酸二鈉來增加維生素C脂質體的穩(wěn)定性[7]。

制備的維生素C脂質體的平均Zeta電位為（-40.8±2.3）mV，而平均Zeta電位在-30～60 mV之間的脂質體溶液是很穩(wěn)定的，不易泄漏[3]。

本文制備的脂質體包封率達到（49.79±1.6）%，且粒徑分布均勻、形態(tài)規(guī)整、穩(wěn)定性好。本方法處方工藝簡單、條件溫和、重現(xiàn)性好，可擴大生產(chǎn)，有望進一步制備成維生素C脂質體注射液。

[1]劉沐生.分光光度法測定柚子中的維生素C[J].光譜實驗室，2012，29（5）：2897-2900.

[2]DESAI M P,LABHASETWAR V,AMIDON G L,et al.Gastrointestinal uptake of biodegradable microparticles:Effect of particle size[J].Pharmaceutical Research,1996,13（12）:1838-1845.

[3]牟琳琳，徐洋，蔣宮平，等.改良pH梯度法制備鹽酸小檗堿脂質體[J].中國藥學雜志，2013，48（1）：49-53.

[4]劉偉新，周愛德.紫外分光光度法對幾種新疆產(chǎn)黑加侖中維生素C含量的測定[J].新疆中醫(yī)藥，2007，25（4）：12-14.

[5]杜昌余.納米粒制備方法的篩選及工藝處方優(yōu)化[D].青島：青島科技大學，2013.

[6]陳召紅，劉皈陽，魏亞超.脂質體包封率測定方法研究進展[J].解放軍藥學學報，2011，27（1）：79-82.

[7]劉亞文，曹光群，陳婷婷.維生素C脂質體的制備研究[J].大豆科學，2007，26（2）：270-272.

（責任編輯：朱小惠）

Preparation of vitamin C liposomes by the pH gradient method

LIU Liming,XU Xingmin
（Chemical Engineering College,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042,China）

Vitamin C liposomes were prepared by the pH gradient method.The entrapment efficiency and the size of vitamin C liposomes were detected by UV-visible spectrophotometry and particle analyzer,respectively.Effects of various factors on the entrapment efficiency including exterior pH,ultrasonic time,incubation temperature and the ratio of drug to lipid,were investigated. The results showed that the entrapment efficiency increased with the decrease of pH and increase of incubation temperature.,The optimal ultrasonic time and ratio of drug to drug was 15 min and 1∶5.The entrapment efficiency of vitamin C liposomes under the optimized conditions was 49.8% and the mean diameter was 118.3 nm.

vitamin C;liposome;pH gradient method;entrapment efficiency

TQ469

A

1674-2214（2015）02-0017-03

2014-11-11

劉力銘（1988—），男，遼寧丹東人，碩士，研究方向為藥物新劑型，E-mail：403005919@qq.com.