早期胃癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子標(biāo)志物的研究進展

林 潔 毛建山

早期胃癌（EGC）是指腫瘤局限于黏膜或黏膜下層，無論是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。EGC的診斷率在日本可達70%左右，內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)（ESD）、內(nèi)鏡下黏膜切除術(shù)（EMR）等內(nèi)鏡切除技術(shù)目前已成為無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EGC治療的重要方法。內(nèi)鏡治療具有微創(chuàng)，術(shù)后恢復(fù)快，能保持消化道的完整性等優(yōu)點，日本EGC患者中約50%接受內(nèi)鏡治療，然而內(nèi)鏡切除術(shù)只是局部的切除手術(shù)，不適用于已有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EGC患者，因此判斷或預(yù)測EGC的侵襲性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況成為EGC患者選擇手術(shù)治療或是內(nèi)鏡治療的關(guān)鍵。EGC的內(nèi)鏡形態(tài)學(xué)特征以及超聲內(nèi)鏡、CT、正電子發(fā)射型計算機斷層顯象（PET－CT）等影像學(xué)檢查為判斷胃癌侵襲性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況提供了重要依據(jù)，但形態(tài)學(xué)檢查有一定局限性，因此尋找反映EGC侵襲轉(zhuǎn)移能力和預(yù)后差異的分子標(biāo)志物具有重要的臨床意義。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力涉及許多分子信號通路的異常改變［1］，本文就EGC侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子標(biāo)志物的研究進展作一綜述。

1 細胞黏附相關(guān)分子

E－鈣黏蛋白（E－cadherin）是一種重要的黏附分子，參與細胞與細胞間的黏附，其表達下調(diào)將導(dǎo)致腫瘤細胞相互分離，獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力［2］。其編碼基因CDH1的雜合失活性種系突變可導(dǎo)致遺傳性彌漫型胃癌的發(fā)生［3］，可見E－cadherin在胃癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。E－cadherin與另一介導(dǎo)細胞黏附的分子β－連環(huán)蛋白（β－catenin）形成復(fù)合體參與細胞間的黏附連接，兩者在正常上皮細胞上均為膜性表達。當(dāng)它們從膜性表達轉(zhuǎn)變?yōu)榘|(zhì)內(nèi)表達時，則預(yù)示著細胞的游離性及轉(zhuǎn)移潛力增強。Yoshii等［4］采用免疫組化研究28例EGC患者的E－cadherin和β－catenin表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，結(jié)果顯示兩者雙重膜性丟失與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并與腸型EGC的關(guān)系更為密切。Yi Kim等［5］進一步研究E－cadherin膜表達下調(diào)的機制，結(jié)果提示CDH1的啟動子甲基化導(dǎo)致了E－cadherin膜表達的下調(diào)。Lee等［6］對浸潤至黏膜下層的EGC患者其黏膜下層與黏膜層E－cadherin表達的差異進行研究，結(jié)果顯示黏膜下層E－cadherin的異常表達率（即膜性表達缺失或胞質(zhì)、胞核內(nèi)表達）高于黏膜層，黏膜下層異常表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。

調(diào)節(jié)E－cadherin表達的相關(guān)分子中，抗黏附素（dysadherin）是一種細胞膜糖蛋白，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)使E－cadherin表達下調(diào)，可能與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)［7］。Maehata等［8］采用免疫組化檢測318例黏膜下浸潤的分化型EGC的dysadherin和E－cadherin表達，結(jié)果顯示dysadherin陽性表達（≥50%）合并E－cadherin陰性表達（≥50%）者相比其余形式的組合顯示出更強的侵襲性，與中分化型、更深的黏膜下浸潤、淋巴管浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，而且dysadherin在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達率相比原發(fā)灶更高，提示dysadherin可能參與了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程。

肝腸鈣黏蛋白（CDH17）屬鈣黏蛋白家族，在人體中僅在肝細胞及腸道細胞的基底面表達，與維持細胞極性和細胞間黏附有關(guān)。Lee等［9］采用免疫組化檢測了193例TNM分期Ⅰ期胃癌的CDH17表達，結(jié)果顯示CDH17表達陰性者的術(shù)后5年生存率顯著低于表達陽性者（P＝0.006），并在另一項有關(guān)168例TNM分期Ⅰ期胃癌樣本的研究中得到進一步驗證（P＝0.007）。

2 緊密連接蛋白

緊密連接蛋白（claudin）是構(gòu)成緊密連接的主要成分。claudin的表達在正常胃黏膜、腸化生上皮及胃腺癌中存在差異，claudin－3和claudin－4主要表達于腸化生上皮，而claudin－18主要表達于正常胃黏膜［10］。Matsuda等［10］研究顯示，胃癌浸潤前端claudin－3、claudin－4及claudin－18三者表達均降低的患者預(yù)后明顯差于表達陽性者，并且組織學(xué)上的惡性程度更高。有研究亦報道claudin－4表達降低與未分化型胃癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腹腔轉(zhuǎn)移相關(guān)，生存率明顯低于陽性表達者［11］。Okugawa等［12］采用免疫熒光染色檢測18例黏膜下浸潤型EGC患者的claudin表達情況，結(jié)果顯示黏膜下浸潤區(qū)claudin－3、claudin－7表達顯著低于黏膜內(nèi)的表達，claudin－3表 達 與 Ki－67 標(biāo) 記 指 數(shù) 呈 負 相 關(guān)。Oshima等［13］采用免疫熒光檢測75例分化型EGC的claudin－18表達，結(jié)果顯示其表達低于周圍正常黏膜及腸化生上皮，其中31例黏膜下浸潤型EGC患者的黏膜下浸潤前端claudin－18表達下調(diào)，與Ki－67標(biāo)記指數(shù)呈負相關(guān)，研究進一步采用MKN74胃癌細胞系進行體外實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)claudin－18 siRNA作用后，細胞系claudin－18表達下調(diào)，其增殖和侵襲能力均明顯增強，提示claudin－18表達下調(diào)可能與EGC增殖、侵襲能力增強相關(guān)。

3 基因組拷貝數(shù)變異

基因組拷貝數(shù)變異（CNA），即基因序列的獲得、缺失或擴增，可引起原癌基因的擴增及抑癌基因的缺失，與腫瘤發(fā)展相關(guān)。Kuroda等［14］采用比較基因組雜交技術(shù)（CGH）進行配對比較23例黏膜下浸潤型EGC患者黏膜內(nèi)和黏膜下層的CNA，結(jié)果顯示兩者的數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而同一病例CNA表現(xiàn)出相似性和異質(zhì)性，如染色體7p12擴增僅出現(xiàn)于黏膜內(nèi)，而11q13獲得僅出現(xiàn)于黏膜下層，提示11q13獲得可能與黏膜下浸潤有關(guān)。比較有和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的黏膜下浸潤型EGC患者的黏膜下層組織（12例比15例）的CNA，結(jié)果顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EGC黏膜下層檢測到11q13、11q14、11q22、14q32獲得及17q21擴增的情況更多，提示腫瘤亞群的這些改變可能獲得淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力。同時免疫組化發(fā)現(xiàn)原癌基因ERBB2的過表達與17q21的擴增相關(guān)，提示ERBB2可能與黏膜下浸潤型早期胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

Nakayama等［15］為研究與管狀腺癌進展有關(guān)的遺傳改變，采用微陣列比較基因組雜交技術(shù)（aCGH）分析管狀腺癌的CNA，結(jié)果顯示13例黏膜內(nèi)癌患者中9例為MYC缺失和TP53獲得（MYC－／TP53＋），3例為 MYC獲得和／或 TP53缺失（MYC＋和／或TP53－）；9例發(fā)生黏膜下侵犯的管狀腺癌中，黏膜層的CNA有7例為 MYC－／TP53＋，而深部浸潤區(qū)僅1例為 MYC－／TP53＋，6例為MYC＋和／或TP53－，可見黏膜內(nèi)管狀腺癌以MYC－／TP53＋為主，而進展期管狀腺癌深部浸潤區(qū)以MYC＋和／或TP53－為主，提示 MYC＋和／或TP53－可能與管狀腺癌的進展有關(guān)。Nakayama等［15］將胃癌含 MYC－／TP53＋者定義為休眠型，含MYC＋和／或 TP53－者定義為侵襲型。Sonoda等［16］進一步對未分化型胃癌（UGC）進行aCGH分析，其中包括組織類型含“層狀結(jié)構(gòu)（LS，代表印戒細胞癌發(fā)展初始階段）”的印戒細胞癌（LS＋UGC）20例及含少量腺管（TC）成分而不含LS的進展期低分化癌（LS－／TC＋UGC）9例，結(jié)果LS＋UGC中侵襲型占46%，LS－／TC＋UGC中侵襲型占77%，且兩者均未見休眠型。提示兩者的惡性程度均較高，而后者可能預(yù)后更差，進一步采用非監(jiān)督式分層聚類分析，根據(jù)基因譜差異可將上述低分化癌分為兩種類型，結(jié)果顯示A型以LS＋UGC為主，B型以LS－／TC＋UGC為主，B型可見更高頻的驅(qū)動基因獲得（其中與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因為ETS1和Ephrin受體基因），提示B型預(yù)后更差?？梢奙YC和TP53拷貝數(shù)變異可預(yù)測胃癌的侵襲性，而基于aCGH的聚類分析可區(qū)分胃癌預(yù)后更差的亞型，有望應(yīng)用于EGC分子分型。

4 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）是腫瘤遺傳不穩(wěn)定性的一種表現(xiàn)形式，MSI最早發(fā)現(xiàn)于遺傳性非家族息肉病性結(jié)直腸癌（HNPCC）中，約90%的HNPCC存在MSI，HNPCC是一種錯配修復(fù)基因突變引起的常染色體顯性遺傳疾病，DNA錯配修復(fù)功能的喪失導(dǎo)致MSI的發(fā)生。Miyoshi等［17］檢測了78例黏膜內(nèi)EGC的5個微衛(wèi)星位點（D17S855、D18S58、D18S61、BAT25和BAT40），其中38例為單發(fā)型EGC（無復(fù)發(fā)），26例為繼發(fā)同時性多發(fā)性胃癌（隨訪1年內(nèi)復(fù)發(fā)），14例為繼發(fā)異時性多發(fā)性胃癌（隨訪1年以上復(fù)發(fā)），結(jié)果顯示繼發(fā)同時性或異時性多發(fā)性胃癌者 MSI陽性率（13／40）顯著高于單發(fā)型（4／38），MSI陽性的單發(fā)型胃癌患者在隨訪中再發(fā)胃癌的累積發(fā)生率顯著高于MSI陰性者。此外，Hasuo等［18］對110例行ESD治療的 EGC進行MSI分析和免疫組化檢測錯配修復(fù)蛋白hMLH1表達，結(jié)果顯示高頻 MSI（多位點的 MSI）且hMLH1表達缺失者（9例），在3年的觀察期中，異時性胃癌的復(fù)發(fā)率為67%，顯著高于其他類型EGC。提示MSI可以作為預(yù)測EGC內(nèi)鏡下治療后異時性復(fù)發(fā)的指標(biāo)。

5 腫瘤干細胞表面標(biāo)志物

腫瘤干細胞（CSC）是具有自我更新及多向分化潛能的腫瘤細胞亞群［19］。Takaishi等［20］在胃癌細胞系無黏附培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)部分胃癌細胞系具有成球狀集落現(xiàn)象，將其植入免疫缺陷小鼠，可生長成皮膚腫瘤，該結(jié)果提示胃癌干細胞的存在。此外，Takaishi 等［21］在研究MKN－45、MKN－74 和NCI－N87人胃癌細胞系時發(fā)現(xiàn)，CD44可能是胃癌干細胞的表面標(biāo)志物。Chen等［22］對16項研究進行薈萃分析，結(jié)果提示標(biāo)志物CD44陽性表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ／Ⅳ期等預(yù)后不良因素相關(guān)，并且比陰性表達者的預(yù)后更差，總生存率更低。CD133也是多種腫瘤的腫瘤干細胞表面標(biāo)志物，Lee等［23］對100例進展期胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)情況進行研究，發(fā)現(xiàn)CD133陽性表達者（n＝23）5年無病生存率為28%，而陰性表達者為65.8%，提示CD133與進展期胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)。目前CSC表面標(biāo)志物與EGC預(yù)后關(guān)系的報道不多，Hirata等［24］進行了一項前瞻性研究，對65例早期胃癌ESD標(biāo)本進行免疫組化檢測CD44v9表達，術(shù)后隨訪36個月，監(jiān)測患者的復(fù)發(fā)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)13例復(fù)發(fā)，其中10例CD44v9表達陽性，CD44v9陽性表達組的復(fù)發(fā)率（76.9%）顯著高于陰性組（5.8%），風(fēng)險比（HR）為21.8，其中有1例CD44v9高度表達者，術(shù)后復(fù)發(fā)2次。以上研究提示CD44v9有望成為預(yù)測ESD術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險的分子標(biāo)志物。

6 miRNA

miRNA是一類由18～25個核苷酸組成的非編碼小RNA，通過與靶基因mRNA堿基配對降解mRNA或阻礙其翻譯，起到靶基因沉默作用。miRNA在腫瘤中根據(jù)其作用靶基因的不同，可起促進腫瘤生長、轉(zhuǎn)移或抑制作用［25－26］。研究表明，miRNA與胃癌的預(yù)后關(guān)系密切，可作為預(yù)后判斷標(biāo)志物，如胃癌 miR－10b、miR－21、miR－212高表達，或miR－125a、miR146a等低表達均提示胃癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險提高，預(yù)后不良［25］。Shin等［27］研究了59例 EGC組織miRNA－135a的表達，結(jié)果顯示發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者miRNA－135a表達下調(diào)率（75%）顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（27.5%），同時免疫組化檢測腫瘤ROCK1表達，結(jié)果顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者ROCK1（miRNA－135a的靶基因之一）陽性表達率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。進一步用極少表達miRNA－135a的SNU668和表達MiRNA－135a的YCC2胃癌細胞系進行實驗，發(fā)現(xiàn)SNU668細胞系加入miRNA－135a類似物后，細胞生存、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲轉(zhuǎn)移能力均減弱，Western－blot顯示ROCK1表達明顯降低；YCC2細胞系加入miRNA－135a抑制劑后，細胞生存、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲轉(zhuǎn)移能力均增強，Western－blot顯示ROCK1表達明顯提高；YCC2細胞系同時加入 miRNA－135a抑制劑和 ROCK1 siRNA后，ROCK1表達明顯下降，細胞系侵襲轉(zhuǎn)移能力均減弱。提示EGC中miRNA－135a通過下調(diào)ROCK1表達實現(xiàn)對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的抑制作用。

7 展望

隨著EGC侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)分子標(biāo)志物研究的不斷進展，有望對EGC進行分子分型，并進一步明確各個亞型的臨床意義，指導(dǎo)EGC患者選擇最佳的治療方案。

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