結(jié)直腸癌早期診斷的分子生物學(xué)研究進(jìn)展

張觀坡 柏 愚 李兆申

結(jié)直腸癌（CRC）是全球第三位高發(fā)的癌癥，同時也是癌癥致死的第四大病因［1］。早期發(fā)現(xiàn)、早期治療是減少CRC發(fā)病率和病死率的有效手段。結(jié)腸鏡檢查是目前篩查CRC的金標(biāo)準(zhǔn)，美國50歲以上人群的結(jié)腸鏡篩查率只有29.8%～55.2%［2］，中國適齡人群的結(jié)腸鏡受檢率也偏低［3］。此外，結(jié)腸鏡檢查存在一定的漏檢率，如結(jié)腸腺瘤的漏檢率可達(dá)6%～12%，而CRC的漏檢率亦可達(dá)5%［4］。因此，為了提高適齡人群尤其是CRC高?；颊叩暮Y查率，迫切需要新的篩查手段，如尋找血液或糞便中CRC的腫瘤標(biāo)志物。隨著分子生物學(xué)以及新一代測序技術(shù)的發(fā)展，研究者從患者血液及糞便中發(fā)現(xiàn)了越來越多的腫瘤標(biāo)志物，其中具有較高敏感度和特異度的DNA和RNA具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 DNA

血中游離DNA簡稱循環(huán)核酸，是指循環(huán)血中游離于細(xì)胞外部分的已降解的機(jī)體內(nèi)源性DNA，可以來源于腫瘤細(xì)胞的壞死、凋亡或直接分泌［5］。循環(huán)核酸一般只有70～200 bp［6］，在血液中的含量極其微少使得分離極其困難，但隨著測序技術(shù)的不斷進(jìn)步，目前已可以高度敏感及特異地檢測血液中微量的循環(huán)核酸，從而為尋求新的早期無創(chuàng)篩查CRC的標(biāo)志物提供了可能［7］。

1.1 異常DNA甲基化

DNA甲基化對細(xì)胞的正常分化和胚胎的發(fā)育極其重要，但是異常的DNA甲基化卻與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。早在1983年，F(xiàn)einberg等［8］就報(bào)道了DNA異常甲基化和腫瘤發(fā)生的關(guān)系。DNA甲基化可以沉默基因的表達(dá)，如抑癌基因啟動子CpG島的高甲基化可以引起DNA雙鏈更緊密地折疊而影響轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致癌癥［9-10］。很多研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化與腫瘤發(fā)生的早期事件相關(guān)，因而其被認(rèn)為是一個潛在的早期腫瘤檢測指標(biāo)［11-12］。

目前，僅有少數(shù)幾個DNA甲基化的標(biāo)志物實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。如ColoVantage○R是一種基于檢測血漿中SEPT9基因甲基化的試劑盒，其對CRC的總體敏感度達(dá)90%，其中對1期和2期CRC的敏感度為87%，對3期和4期CRC的敏感度達(dá)100%［13］。Epi proColon○R2.0亦是一種基于檢測血漿中SEPT9基因甲基化的試劑盒，其對CRC的總體敏感度達(dá)95.6%，其中對1期CRC的敏感度為84%，對2～4期CRC的敏感度亦達(dá)100%；使用此試劑盒時，其在左半結(jié)腸的陽性率達(dá)96.4%，在右半結(jié)腸的陽性率達(dá)94.4%［14］。ColoSureTM則是一種基于檢測糞便中vimentin基因甲基化的試劑盒，其對CRC的敏感度為38%～88%，該試劑盒被推薦與結(jié)腸鏡檢查聯(lián)合篩查CRC［15］。

不過大部分DNA甲基化的生物標(biāo)志物尚處于科研及臨床試驗(yàn)階段。在21世紀(jì)初，Nakayama等［16］和 Lecomte等［17］檢測到，腫瘤抑制基因 p16的啟動子高甲基化在CRC患者血液中的陽性率分別為68%和69%。而Grady等［18］檢測到hMLH1啟動子異常甲基化在CRC患者血清中的陽性率僅為47%。Oh等［19］研究發(fā)現(xiàn)，異常SDC2甲基化在139例Ⅰ～Ⅳ期CRC患者腫瘤組織中的表達(dá)率為97.8%，而血清中SDC2甲基化的敏感度為87.0%，特異度為95.2%，特別是在Ⅰ期CRC患者的敏感度可高達(dá)92.3%，使其可以作為潛在的早期檢測CRC的標(biāo)志物。而對于糞便來源的DNA，由于各研究對標(biāo)本處理的方法存在更大的異質(zhì)性，使得目前研究結(jié)果并不令人滿意。如 Gl?ckner等［20］發(fā)現(xiàn)，TFPI2的異常甲基化在CRC腺瘤的檢出率為97%，在Ⅰ～Ⅳ期CRC患者腫瘤組織中更高達(dá)99%；而其在Ⅰ～Ⅲ期CRC患者的糞便標(biāo)本中敏感度為76%～89%，特異度為79%～93%。其他學(xué)者在CRC患者糞便中檢測到的NDRG4啟動子及轉(zhuǎn)錄因子GATA4等基因的異常甲基化雖然敏感度僅為51%～53%，但特異度可達(dá)93%～100%。即便如此，這些研究仍需擴(kuò)大樣本以進(jìn)一步驗(yàn)證。

鑒于檢測單個基因的局限性，許多學(xué)者采用聯(lián)合檢測多基因甲基化的策略以提高敏感度和特異度。Lind等［21］聯(lián)合檢測血清中 CNIP1、FBN1、INA、SNCA、MAL和SPG20，發(fā)現(xiàn)≥2個以上上述基因的啟動子出現(xiàn)高甲基化，其敏感度在腺瘤和CRC中分別為93%和94%，特異度可達(dá)98%。Alhquist等［22］則聯(lián)合檢測了糞便中骨形成蛋白3（BMP3）、NDRG4、vimenti、TFPI2、突變型 KRAS、β-肌動蛋白（β-actin）等基因的甲基化，其對CRC的敏感度可達(dá)87%。相信隨著研究的進(jìn)展，將來一定會出現(xiàn)更多的優(yōu)化組合標(biāo)志物，可進(jìn)一步提高CRC早期檢測的敏感度和特異度。

1.2 異常的腫瘤DNA突變

在結(jié)直腸正常上皮細(xì)胞由腺瘤向腺癌的發(fā)生過程中，突變的基因如KRAS、p53、APC可以在血循環(huán)中被檢測到［17，23-24］，但與野生型 DNA 相比，含量非常低［25］。例如，Diehl等［24］研 究 發(fā)現(xiàn)，59% 的CRC患者（n＝56）血漿中可以檢測到突變的APC，但其中晚期CRC患者的血漿中突變的APC基因僅占總APC基因的1.9%～27%，而早期CRC患者則僅有0.01%～0.12%。即便使用直接測序技術(shù)，在野生型DNA的背景中，其突變信號的檢出率也低于25%［26］。因此，目前的技術(shù)尚難以開發(fā)低成本且具高敏感度的方法用來檢測所有體細(xì)胞突變，作為早期檢測CRC的指標(biāo)。

1.3 微衛(wèi)星改變

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）是指與正常組織相比，在腫瘤中某一微衛(wèi)星由于重復(fù)單位的插入或缺失而造成的微衛(wèi)星長度的任何改變，出現(xiàn)新的微衛(wèi)星等位基因現(xiàn)象。雜合性是指在同源染色體上的一個或多個位點(diǎn)上有不同等位基因存在的狀態(tài)。微衛(wèi)星改變包括MSI和失去雜合性，與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展相關(guān)，因而被認(rèn)為可作為潛在的腫瘤檢測指標(biāo)［27］。Hibi等［28］研究發(fā)現(xiàn)，80%的原發(fā)性 CRC 中存在MSI或失去雜合性的改變，但無1例出現(xiàn)在相應(yīng)患者的血清DNA中。總體上，在檢測早期CRC時，微衛(wèi)星改變表現(xiàn)出較低的敏感度和特異度，目前尚難以作為早期檢測CRC的指標(biāo)。

1.4 循環(huán)線粒體DNA

在每個細(xì)胞中均有數(shù)以百計(jì)的線粒體DNA拷貝，而正是由于其多拷貝的特性，線粒體DNA通常表現(xiàn)出異質(zhì)性。對腫瘤細(xì)胞而言，除了表現(xiàn)出與特定腫瘤相關(guān)的異質(zhì)性之外，還存在D-襻區(qū)域的變異［29］。Hibi等［30］研究發(fā)現(xiàn)，在早期 CRC中，近9%（7／77）的CRC組織存在線粒體DNA的改變，但在這7例患者中，僅有1例的血清中存在線粒體DNA的改變。鑒于線粒體DNA在早期CRC中極低的陽性率，更多的研究將重點(diǎn)放在其與CRC晚期轉(zhuǎn)移的關(guān)系上。

2 RNA

通常認(rèn)為RNA是一種高度不穩(wěn)定、容易降解的小分子物質(zhì)，但隨著研究的深入，許多研究證實(shí)RNA可以穩(wěn)定的存在于外周血中，這可能與其在血液中與蛋白質(zhì)或磷脂相結(jié)合，從而可以抵御RNA酶降解有關(guān)［31］。這些RNA包括編碼RNA［如信使RNA（mRNA）］及非編碼 RNA［如微小 RNA（microRNA）和長鏈非編碼 RNA（lncRNA）］［32-33］。不僅如此，這些RNA還可以在血漿或血清中被抽提及檢測出來［34-35］作為潛在的腫瘤標(biāo)志物［36］。

2.1 mRNA

mRNA是由DNA的一條鏈作為模板轉(zhuǎn)錄而來的、攜帶遺傳信息的能指導(dǎo)蛋白合成的一類單鏈核糖核酸。mRNA的研究策略是通過分析mRNA芯片特征繼而使用RT-PCR進(jìn)行確證。

Tsouma等［37］通過提取CRC患者的外周血RNA并使用多重RT-PCR技術(shù)分析癌胚抗原（CEA）、細(xì)胞角蛋白20（CK20）、表皮生長因子受體（EGFR）mRNA的改變，發(fā)現(xiàn)其陽性率分別為95.5%、78.4%和19.3%，并且其與疾病分期及術(shù)前CEA水平呈正相關(guān)。但目前關(guān)于mRNA和CRC的研究資料不多，可能與芯片技術(shù)逐漸被新一代測序技術(shù)取代有關(guān)。

2.2 microRNA

microRNA是一類進(jìn)化上保守的非編碼單鏈小RNA分子，長度約為18～25個核苷酸，其最早是由Lee等［38］于1993年在秀麗新小桿線蟲中發(fā)現(xiàn)的。microRNA通過與其靶mRNA上的互補(bǔ)序列的堿基配對，進(jìn)而引起轉(zhuǎn)錄抑制或mRNA降解［39］?？梢杂梢粋€microRNA調(diào)控多個目的基因的表達(dá)，也可以由幾個microRNA調(diào)節(jié)同一個基因的表達(dá)［40］。異常的microRNA表達(dá)可以作為早期腫瘤的診斷標(biāo)志物。

Michael等［41］于2003年最先分析了28種microRNA在人CRC組織與正常黏膜組織中的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-143和miR-145具有顯著差異。而Ng等［42］于2009年首次使用實(shí)時PCR技術(shù)篩選了CRC患者血漿中95種microRNA的變化，其中miR-17-3p和miR-92顯著升高，其敏感度為89%、特異度為70%。至今為止，有多達(dá)數(shù)十種血漿中的microRNA被提出來作為CRC的腫瘤標(biāo)志物，其敏感度為68%～91%、特異度為41%～95%。在這些microRNA中，原癌基因性microRNA如miR-17、miR-21、miR-31、miR-92a、miR-106a、miR-106b、miR-135a、miR-135b和 miR-155的表達(dá)上調(diào)與CRC相關(guān)，而抑癌基因性microRNA如miR-143、miR-145 miR-148a、miR-148b和miR-215的表達(dá)下調(diào)亦與CRC相關(guān)。另一方面，在CRC血循環(huán)中表達(dá)上調(diào)的 miR-15b、miR-17-5p、miR-18a、miR-142-3p、miR-195、miR-331、miR-532-5p、miR-532-3p、miR-652以及表達(dá)下調(diào)的miR-601、miR-760被認(rèn)為可以鑒別進(jìn)展期腺瘤和CRC，并且miR-15b、miR-17-3p、miR-18a、miR-20a、miR-21、miR-29a和miR-92a都已被超過一個研究小組報(bào)道過。盡管如此，仍有相當(dāng)多的研究結(jié)果未被其他研究者所重復(fù)，如Faltejskova等［43］的研究并沒有證實(shí)miR-17-3p、miR-29a、miR-92a、和 miR-135b可作為CRC的腫瘤標(biāo)志物。這些不一致的研究結(jié)果可能是由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、患者來源以及實(shí)驗(yàn)條件不同引起的。因此，將來需要確立標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)控制條件后進(jìn)行更大范圍的多中心研究，才可能確定哪些microRNA可以作為CRC腫瘤標(biāo)志物。

2.3 lncRNA

lncRNA為長度超過200 nt的RNA分子，其不直接編碼蛋白，而是以RNA的形式在多個層面上調(diào)控基因的表達(dá)水平。lncRNA最初被認(rèn)為是“垃圾RNA”，但隨著研究的深入，lncRNA成為近年來生命科學(xué)研究的前沿和熱點(diǎn)，其對基因的調(diào)節(jié)及細(xì)胞的功能發(fā)揮著極其重要的作用［44］，尤其是在腫瘤抑制及生成中的作用，因此lncRNA作為癌癥潛在的腫瘤標(biāo)志物也越來越受到重視［45］。

目前僅有的研究都是以CRC組織作為標(biāo)本。如Ge等［46］研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌相關(guān)lncRNA轉(zhuǎn)錄因子1在CRC組織中上調(diào)，但附近的正常組織為陰性表達(dá)。Zhai等［47］研究發(fā)現(xiàn)，長的基因間非編碼RNA-p21在CRC組織中表達(dá)上調(diào)，并且與腫瘤進(jìn)展相關(guān)。Ling等［48］發(fā)現(xiàn)lncRNA-CCAT2在CRC組織中高度表達(dá)，并且可以促進(jìn)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和染色 體 的 不 穩(wěn) 定。Kogo 等［49］發(fā) 現(xiàn) lncRNAHOTAIR的表達(dá)在晚期CRC的組織中表達(dá)較高。Xu等［50］則發(fā)現(xiàn)lncRNA-人肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1（MALAT-1）在CRC組織中表達(dá)下調(diào)。鑒于lncRNA在基因調(diào)控中的重要作用以及隨著下一代測序技術(shù)的進(jìn)步及普及，將來會有更多的血循環(huán)lncRNA和CRC相關(guān)研究出現(xiàn)。

3 結(jié)語

早期篩查CRC是減少CRC發(fā)病率及病死率的最有效手段。雖然目前最有效的篩查方法仍是結(jié)腸鏡檢查，但考慮到其較低的受檢率，迫切需要新的篩查手段，其必須滿足價格低廉、低風(fēng)險、高敏感度并且不需要繁瑣的腸道準(zhǔn)備等優(yōu)點(diǎn)，才可以提高公眾尤其是高風(fēng)險人群進(jìn)行CRC篩查的意愿。通過分析患者血液或糞便中DNA或RNA的變化，可以有效尋找到高敏感度及特異度的早期CRC腫瘤標(biāo)志物。雖然在目前的研究中，這些腫瘤標(biāo)志物尚難以廣泛應(yīng)用于臨床，但隨著下一代測序技術(shù)的進(jìn)步及普及，相信可以尋找到更加特異的早期CRC腫瘤標(biāo)志物。

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