寬筋藤藥材UPLC特征圖譜研究

遲森森 韓丹 劉斌

·論著·

寬筋藤藥材UPLC特征圖譜研究

遲森森 韓丹 劉斌

目的 建立寬筋藤藥材的超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography, UPLC)特征圖譜,為寬筋藤藥材的整體質(zhì)量分析和評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。方法 采用Waters Acquity C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm),流動(dòng)相0.1%甲酸乙腈溶液(A)-0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脫,流速為0.5 m L/min,柱溫為30℃ ,檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm。采用聚類分析和特征圖譜相似度分析對(duì)16批不同地區(qū)的寬筋藤商品藥材UPLC特征圖譜進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果 建立了寬筋藤藥材的UPLC特征指紋圖譜共有模式,共標(biāo)定了35個(gè)共有峰。聚類分析將16批寬筋藤商品藥材分為4類,特征圖譜經(jīng)國(guó)家藥典規(guī)定的相似度計(jì)算軟件計(jì)算,整體相似度良好。結(jié)論 本研究建立的寬筋藤藥材特征圖譜的特征性和專屬性強(qiáng),方法準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好,可用于寬筋藤藥材的整體質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)。

寬筋藤; 特征圖譜; 超高效液相色譜; 聚類分析; 質(zhì)量控制

寬筋藤Tinosporae sinenisis(Lour.)Merr.來(lái)源于防己科植物中華青牛膽的干燥藤莖[1],具有祛風(fēng)止痛,舒筋活絡(luò)的功效,中醫(yī)用其治療風(fēng)濕痹痛,腰肌勞損,跌打損傷[2]。寬筋藤在藏醫(yī)藥中又名“勒哲”,《甘露之池》中記載“勒哲味甘、苦、澀、辛,化味甘、酸,性潤(rùn)、涼、溫,治龍、赤巴合并癥、培根病、風(fēng)濕病、風(fēng)熱病”[3]。藥理研究表明寬筋藤藥材提取物具有抗氧化、抗炎、保肝和免疫調(diào)節(jié)等方面藥理活性[4-6],這是其所含的生物堿類、甾體類、萜類、香豆素類和氨基酸等成分協(xié)同作用的結(jié)果[2]。但目前國(guó)內(nèi)有關(guān)寬筋藤藥材活性成分的研究報(bào)道比較少,缺乏整體性的化學(xué)表征。且其在廣東、海南、廣西和云南等地多有分布,各地區(qū)寬筋藤商品藥材品質(zhì)差異未能有效區(qū)分,其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)幾乎處于空白階段。由于中藥化學(xué)成分的復(fù)雜多樣性,因此任何單一成分含量高低均不能準(zhǔn)確完整的評(píng)價(jià)一味中藥的質(zhì)量[7],基于此,本文采用超高效液相色譜法,建立多元梯度洗脫模式測(cè)定了16批寬筋藤商品藥材飲片的UPLC特征指紋圖譜,可從整體上表征寬筋藤藥材的成分信息,為其整體質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Acquity超高效液相系統(tǒng),包括二元高壓梯度泵、25μL可調(diào)進(jìn)樣器、柱溫箱、PDA全波長(zhǎng)檢測(cè)器和Waters Enprower 3色譜數(shù)據(jù)處理工作站(美國(guó)Waters公司);Sartorious BT 25S型十萬(wàn)分之一電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司); KQ-500DE超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

寬筋藤藥材購(gòu)自全國(guó)14個(gè)不同地區(qū),分別為安國(guó)、成都、廣州、桂林、亳州、昆明、南京、梧州、武漢、新疆、玉林、湛江、青海和北京,共16批樣品,標(biāo)號(hào)為S1～S16。乙腈(Sigma-aldrich公司,色譜純),試驗(yàn)用水均為娃哈哈純凈水,其他試劑均為分析純;所有試劑用前均經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過(guò)。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為 Waters Acquity C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm),PDA檢測(cè)器,流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈溶液(A)-0.1%甲酸水溶液(B),采用梯度洗脫(0.0～3.0分鐘,5%A;3.0～6.0分鐘,5%～7.9% A;6.0～7.5分鐘,7.9%～8.3%A;7.5～9.0分鐘, 8.3%～9.2%A;9.0～10.5分鐘,9.2% ～9.6% A;10.5～14.5分鐘,9.6%～14.4%A;14.5～17.0分鐘,14.4% ～16.2% A;17.0 ～19.0分鐘, 16.2%～18.8%A;19.0～24.0分鐘,18.8% ～25.0% A;24.0～25.0分鐘,25.0% ～25.5%A),柱溫30℃,流速0.5 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm,進(jìn)樣量2μL。

2.2 樣品溶液的制備

取寬筋藤藥材粉末(60目)約1 g,精密稱定,置100 mL具塞錐形瓶中,精密加入甲醇80 mL,稱定重量,超聲(功率250 W,頻率20 KHz)提取30分鐘,搖勻,放冷,稱重,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,過(guò)濾。濾液減壓回收溶劑至干,殘留物用甲醇溶解并定容至2 mL,經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè),記錄各共有峰保留時(shí)間和峰面積,以峰19(tR=17.532分鐘)為參照物,計(jì)算結(jié)果顯示35個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.02%～0.84%之間,相對(duì)峰面積RSD在0.51% ～2.82%之間,表明儀器精密度良好,符合指紋圖譜檢測(cè)要求。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一批供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于制備后0,3,6,9,12, 24小時(shí)進(jìn)行檢測(cè),記錄各共有峰保留時(shí)間和峰面積,以峰19(tR=17.532分鐘)為參照物,計(jì)算結(jié)果顯示35個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.04%～0.95%之間,相對(duì)峰面積RSD在0.48%～2.93%之間,表明樣品在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次寬筋藤藥材粉末(60目)6份,每份約1 g,精密稱定,按“2.2樣品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備供試品液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè),記錄各共有峰保留時(shí)間和峰面積,以峰19(tR=17.532分鐘)為參照物,計(jì)算結(jié)果顯示35個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.01%～0.34%之間,相對(duì)峰面積RSD在0.70%～2.99%之間,表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 寬筋藤特征圖譜的構(gòu)建和解析

2.4.1 寬筋藤共有峰的確定 取14個(gè)不同地區(qū)16批寬筋藤商品藥材樣品,按“2.2樣品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件對(duì)各批寬筋藤藥材進(jìn)行分析檢測(cè),記錄各色譜峰保留時(shí)間和峰面積。確定在16批寬筋藤特征圖譜中出峰時(shí)間基本一致、峰面積較大的35個(gè)峰為共有特征色譜峰,其共有峰面積之和均占原有色譜圖所有峰面積的90%以上,結(jié)果見(jiàn)圖1、2。其中19號(hào)峰(tR=17.532分鐘)分離度較好,且保留時(shí)間和峰面積適中,因此選擇19號(hào)峰作為內(nèi)參比峰,計(jì)算其他各色譜峰對(duì)內(nèi)參比峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值在0.01%～1.06%之間,說(shuō)明16批樣品之間的共有模式穩(wěn)定,而相對(duì)峰面積的RSD值則比較大,說(shuō)明不同批次寬筋藤商品藥材之間的質(zhì)量存在一定差異。

2.4.2 聚類分析 將16批寬筋藤商品藥材的UPLC圖譜中共有峰的峰面積值標(biāo)準(zhǔn)化處理,運(yùn)用SPSS 16.0軟件對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,采用組間連接法,利用歐式距離作為樣品的測(cè)度,可將樣品分為4類,結(jié)果見(jiàn)圖3。聚類分析結(jié)果表明寬筋藤商品藥材質(zhì)量差異在全國(guó)分布無(wú)明顯地域特征,但在一些相鄰的省份藥材質(zhì)量較為相似。S9和S7,S13和S4分別在同一類中,可能是寬筋藤作為民族藥,主產(chǎn)于廣州、廣西、云南三省南部。S1、S16、S6、S8均在同一類中,則可能是由于安國(guó)和亳州為中藥材市場(chǎng)的聚集地,而北京和南京分別緊鄰這兩個(gè)城市,購(gòu)買地相似所致。S15、S2、S11均在同一類中,可能是這3批藥材的購(gòu)買地都地處中國(guó)的西部,貨源相似。

2.4.3 特征圖譜相似度計(jì)算 采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A)》對(duì)16批寬筋藤商品藥材的UPLC圖譜進(jìn)行相似度分析,以所建立的寬筋藤特征圖譜共有峰作為參照,分別進(jìn)行時(shí)間窗的設(shè)定、譜峰匹配,進(jìn)行相似度計(jì)算,結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知,16批寬筋藤商品藥材相似度在0.779～0.969之間,其中11批商品藥材相似度在0.900以上,藥材質(zhì)量較好。而購(gòu)自安國(guó)、桂林、新疆、北京和湛江的寬筋藤商品藥材相似度在0.779～0.879之間,藥材質(zhì)量一般。

3 討論

通過(guò)對(duì)提取方式(超聲、加熱回流),藥材粉碎度(40、60、80目),提取溶劑(甲醇、70%甲醇、50%甲醇),溶劑倍量(10、20、40、80、160倍量),提取時(shí)間(15、30、45、60分鐘)進(jìn)行考察,最終確定寬筋藤藥材提取方法為:藥材粉碎至60目,加入80倍量甲醇溶液,超聲提取30分鐘(功率250W,頻率20 KHz)。

分別考察了乙腈-水、0.1%甲酸乙腈溶液、0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液3個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng),結(jié)果表明采用0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液流動(dòng)相系統(tǒng),各峰分離度較好,且基線平穩(wěn),最有利于特征圖譜的分析。同時(shí)采用Waters二級(jí)管陣列檢測(cè)器對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了選擇,通過(guò)比較254 nm、320 nm和340 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下的色譜圖,以圖譜提供的色譜峰的信息量和峰面積為考察指標(biāo),發(fā)現(xiàn)在320 nm波長(zhǎng)下,色譜峰信息量最大,因此選擇320 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

在中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)的輔助下,得出了寬筋藤藥材的UPLC對(duì)照特征圖譜。比較16批寬筋藤商品藥材特征圖譜后發(fā)現(xiàn),不同地區(qū)寬筋藤藥材特征圖譜中主要峰群的整體圖貌基本一致,相似度在0.779～0.969之間,說(shuō)明不同地區(qū)藥材中各成分含量的相對(duì)比值有所差別。這種在共性特征基礎(chǔ)上存在的個(gè)體差異是常見(jiàn)的現(xiàn)象,因?yàn)樗幉纳a(chǎn)過(guò)程中受到土壤、氣候、環(huán)境因素及采收加工過(guò)程中很多因素的影響,通過(guò)量化比較可以為選購(gòu)原料藥材及指導(dǎo)GAP提供質(zhì)量信息。

特征圖譜是目前控制中藥材質(zhì)量最有效、最直觀的手段之一。有關(guān)寬筋藤藥材的質(zhì)量控制在中國(guó)藥典和各地方藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有詳細(xì)的規(guī)定。本文采用UPLC方法,建立了寬筋藤藥材的特征圖譜。結(jié)果表明該方法穩(wěn)定、可靠、重現(xiàn)性好,可為寬筋藤藥材質(zhì)量分析、評(píng)價(jià)與控制提供依據(jù)。

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Study on UPLC specific chrom atogram of caulis tinosporae sinenisis

CHISen-sen,HAN Dan,LIUBin. School ofChinese Materia Medica,Beijing University ofChinese Medicine,Beijing 100102,China Corresponding author:LIU Bin,E-mail:liubinyn67@163.com

Objective To establish the ultra performance liquid chromatography(UPLC)specific chromatogram of caulis tinosporae sinenisis,in order to provide reference basis for overall quality analysis and evaluation of caulis tinosporae sinenisis.M ethods Analysiswas performed on theWaters Acquity C18column(2.1mm×50mm,1.7μm),the acetonitrilewith 0.1%formic acid(A)-0.1%formic acid(B) was adopted asmobile phase in gradient elution mode,and monitored under 320 nm wavelength.The flow rate was set at 0.5 mL/min and the column temperature was set at 30℃.Sixteen batches of caulis tinosporae sinenisismedicinalmaterial samples collected from different areaswere analyzed by hierarchical clustering analysis(HCA)and similarity analysis(SA)to evaluate the UPLC specific chromatogram. Results Thirty-five common peaks were selected to establish the UPLC specific chromatogram of caulis tinosporae sinenisis.Sixteen batches ofmedicinalmaterial sampleswere classified as four clusters by HCA and a good overall similarity was calculated by the overall similarity software specified in the national pharmacopeia.Conclusions The established method for specific chromatogram by UPLC with better characteristic and specificity was accurate,reliable and repeatable,which could be applied to the overall quality control and evaluation of caulis tinosporae sinenisis.

Caulis tinosporae sinenisis; Specific chromatogram; UPLC; Hierarchical cluster analysis; Quality control

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.09.013

2015-02-02)

(本文編輯:董歷華)

北京中醫(yī)藥大學(xué)自主選題(2013-JYBZZ-XS-116)

100102 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院[遲森森(碩士研究生)、韓丹、劉斌]

遲森森(1990-),女,2014級(jí)在讀碩士研究生。研究方向:中藥(復(fù)方)有效成分(組分)發(fā)現(xiàn)與新藥創(chuàng)制。E-mail: m17801085298@163.com

劉斌(1967-),博士,教授。研究方向:中藥(復(fù)方)有效成分(組分)發(fā)現(xiàn)與新藥創(chuàng)制。E-mail:liubinyn67@163.com