骨疏顆粒對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨密度及血清細(xì)胞因子的影響

毛海琴 杜義斌 徐瑩 閔曉黎 李曉燕

·論著·

骨疏顆粒對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨密度及血清細(xì)胞因子的影響

毛海琴 杜義斌 徐瑩 閔曉黎 李曉燕

目的 觀察骨疏顆粒對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨密度及血清細(xì)胞因子的影響,探討骨疏顆粒防治骨質(zhì)疏松癥的可能作用機(jī)制。方法 將3月齡SD雌性大鼠40只,按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、戊酸雌二醇組及骨疏顆粒組?？瞻捉M只行假手術(shù),其余3組用去大鼠雙側(cè)卵巢復(fù)制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的模型。術(shù)后3天分別給戊酸雌二醇及骨疏顆粒灌胃,12周后檢測血清白細(xì)胞介素(interleukin,IL)1β、IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α及左股骨骨密度。結(jié)果(1)與空白組比較,模型組骨密度顯著下降,血清IL-1β及IL-6顯著增加(P＜0.01),TNF-α增加(P＜0.05);(2)與模型組比較,戊酸雌二醇組骨密度顯著增加(P＜0.01),血清IL-1β顯著降低(P＜0.01),IL-6及TNF-α均降低(P＜0.05);骨疏顆粒組骨密度增加(P＜0.05),血清IL-1β、IL-6及TNF-α均降低(P＜0.05)。結(jié)論 骨疏顆粒對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠有治療作用,其作用機(jī)制可能是通過降低血清中IL-1β、IL-6及TNF-α細(xì)胞因子水平,從而抑制骨吸收。

骨疏顆粒; 骨質(zhì)疏松; 骨密度; 白介素-1β; 白介素-6; 腫瘤壞死因子-α

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種以骨量減少,骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化為特征,導(dǎo)致骨脆性增加及骨折危險(xiǎn)性增加的一種全身代謝性骨病[1]。隨著人口老齡化和人類壽命延長,骨質(zhì)疏松癥已成為全球健康問題[2]。根據(jù)2003至2006年的調(diào)查估算,中國2006年50歲以上人群中約有6944萬人患有骨質(zhì)疏松癥,近2.1億人為低骨量狀態(tài)[3],因此防治骨質(zhì)疏松癥刻不容緩。研究表明,細(xì)胞因子能夠調(diào)節(jié)骨重建,白細(xì)胞介素 1β(interleukin 1beta, IL-1β)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)等細(xì)胞因子能夠增加破骨細(xì)胞活性,促進(jìn)骨吸收,致使骨重建失衡[4-6]。骨疏顆粒是本院治療骨質(zhì)疏松癥的協(xié)定處方,臨床應(yīng)用多年,療效顯著。相關(guān)的臨床研究發(fā)現(xiàn),骨疏顆?？梢愿纳平^經(jīng)后OP的主要癥狀,降低骨吸收代謝指標(biāo),提高絕經(jīng)后OP患者腰椎骨密度[7-8]。為進(jìn)一步明確骨疏顆粒治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制,本研究以去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠為研究對(duì)象,觀察骨疏顆粒對(duì)骨密度及血清細(xì)胞因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無特定病源體(specefic pathogen free,SPF)級(jí)健康SD大鼠,雌性,40只,體質(zhì)量(200±20)g,3月齡,廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物合格證書號(hào):SCXK(粵)2013-0020。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

骨疏顆粒由狗脊30 g、骨碎補(bǔ)15 g、淫羊藿10 g、熟地15 g、杜仲20 g、知母10 g、黃芪20 g、白術(shù)10 g、蒼術(shù)10 g、三七粉3 g、羌活10 g、獨(dú)活10 g,共12味藥組成,為顆粒劑,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)制劑中心制備;戊酸雌二醇片(商品名:補(bǔ)佳樂,拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司,生產(chǎn)批號(hào)069A2);注射用青霉素(華北制藥股份有限公司,生產(chǎn)批號(hào)J3048403)。

1.3 主要試劑與儀器

大鼠TNF-α試劑盒(聯(lián)科生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)批號(hào)238240523);大鼠IL-1β試劑盒(聯(lián)科生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)批號(hào)2301B40534);大鼠IL-6試劑盒(聯(lián)科生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)批號(hào)230640433);AL204-IC電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);Multiscan Mk3-酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD550);遼制00000131-1普通電子天平(沈陽龍騰電子公司);移液器(EPPENDORF);XW-80A旋渦混合器(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司,);XK96-3型微量振蕩器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司,);雙能X線吸收骨密度儀(美國通用電氣公司);F80超低溫冰箱(SANYO公司)。

1.4 動(dòng)物分組及模型建立

將SD雌性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組及模型組、戊酸雌二醇組、骨疏顆粒組4組。每組10只。各組大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉, 0.3 mL/100 g體重,仰臥位固定。75%酒精消毒,沿下腹正中線切口2～3 cm。先將模型組、戊酸雌二醇組、骨疏顆粒組“Y”型子宮角曝露,然后結(jié)扎子宮角,切除雙側(cè)卵巢,空白組只切除卵巢周圍少許脂肪組織,逐層關(guān)閉,縫合切口。術(shù)后連續(xù)肌注青霉素3天,40000 u/只。模型組、戊酸雌二醇組、骨疏顆粒組連續(xù)陰道涂片2個(gè)性周期,示陰道上皮無性周期變化,提示卵巢切除成功。術(shù)后所有大鼠在室溫22.5～24℃及濕度53%～54.5%的SPF級(jí)飼育室飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中,空白組及模型組各脫落1例;戊酸雌二醇組脫落2例?？瞻捉M、模型組及戊酸雌二醇組各1只大鼠于術(shù)后出現(xiàn)腸脹氣,腸梗阻死亡;戊酸雌二醇組1只誤灌藥入肺死亡。

1.5 給藥方法

術(shù)后第4天開始給藥,灌胃的劑量按人與大鼠體表面積比折算成大鼠等效劑量?？瞻捉M灌服蒸餾水1 mL/100 g。模型組按1 mL/100 g灌服蒸餾水,戊酸雌二醇組按0.05 mg/(mL·100 g)給藥,骨疏顆粒組按0.3 g/(mL·100 g)給藥。每日上午灌胃1次,連續(xù)灌胃12周。

1.6 檢測指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)大鼠在最后一次灌胃后,禁食12小時(shí),自由飲水。經(jīng)10%水合氯醛按0.3 mL/100 g體重腹腔麻醉,臥位固定,75%酒精消毒腹部皮膚,腹主動(dòng)脈取血。4℃靜置30分鐘后,以3000 rmp離心15分鐘,分離血清,分裝入Eppendorf管,標(biāo)號(hào),-20℃保存。檢測時(shí)常溫下解凍血清,酶聯(lián)免疫吸附法檢測IL-1β、IL-6及TNF-α。分離左側(cè)股骨,剝離肌肉、肌腱等組織,用0.9%生理鹽水濕潤紗布,包裹離體股骨,-80℃冰箱保存,用于骨密度測定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,方差齊,采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進(jìn)行分析,組間兩兩比較采用LSD分析, P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)左股骨骨密度的影響

組間比較采用單因素方差分析,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與空白組比較,模型組骨密度顯著降低(P＜0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與模型組比較,戊酸雌二醇組骨密度顯著增加(P＜0.01),骨疏顆粒組骨密度增加(P＜0.05),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,具體見表1。

表1 各組大鼠左股骨骨密度比較(±s)

注:與空白組比較,aP＜0.01;與模型組比較,bP＜0.05,cP＜0.01

組別 n 骨密度(g/cm2) 0.219±0.010模型組 9 0.177±0.011a戊酸雌二醇組 8 0.196±0.005c骨疏顆粒組 10 0.187±0.019空白組9 b

2.2 對(duì)血清細(xì)胞因子的影響

采用單因素方差分析對(duì)各組間IL-1β、IL-6及TNF-α進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,IL-1β組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),IL-6組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),TNF-α組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。采用LSD分析進(jìn)行組間兩兩比較,與空白組比較,模型組 IL-1β及 IL-6顯著增加(P＜0.01),TNF-α增加(P＜0.05),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與模型組比較,戊酸雌二醇組IL-1β顯著降低(P＜0.01),IL-6及TNF-α均降低(P＜0.05),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與模型組比較,骨疏顆粒組IL-1β、IL-6及TNF-α均降低(P＜0.05),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),具體見表2。

3 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(Ⅰ型)是指因?yàn)榇萍に丶眲∠陆祵?dǎo)致的以骨吸收增強(qiáng)、骨量減少、骨脆性增加、骨顯微結(jié)構(gòu)退化為特征,易于發(fā)生骨折的一種全身代謝性骨骼疾病[9]。目前,骨質(zhì)疏松癥大鼠模型的制作方法主要有維甲酸灌胃、切除卵巢和灌服糖皮質(zhì)激素造模3種。采用雌性大鼠雙側(cè)卵巢切除方法進(jìn)行造模,是研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的經(jīng)典模型[10]。本研究采用摘除大鼠雙側(cè)卵巢復(fù)制骨質(zhì)疏松癥模型,術(shù)后連續(xù)陰道涂片2個(gè)性周期。研究顯示大鼠陰道上皮性周期變化消失,模型復(fù)制成功。骨密度檢測亦顯示模型組骨密度較空白組明顯降低。

雙能 X線吸收測定法(dual energy X-ray absorptiometry,DXA)測量值是目前國際學(xué)術(shù)界公認(rèn)的骨質(zhì)疏松癥診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。骨疏顆粒能夠提高去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度,此組骨密度與去模型組大鼠比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

骨質(zhì)疏松的發(fā)病過程是骨重建偏向破骨細(xì)胞所致的骨吸收不平衡過程,細(xì)胞因子產(chǎn)生于骨的微環(huán)境中,骨重建過程受到TNF-α、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。TNF-α由骨原細(xì)胞產(chǎn)生,也可以由其他因子誘導(dǎo)產(chǎn)生,具有促進(jìn)破骨細(xì)胞生成,加速骨吸收的作用[11]。IL-1是促破骨細(xì)胞的細(xì)胞因子之一,IL-1可以刺激成骨細(xì)胞產(chǎn)生IL-6與TNF-α細(xì)胞,而且可以與這兩種細(xì)胞因子相互協(xié)調(diào),促進(jìn)骨吸收[12]。本研究中,模型組 IL-1β、IL-6及 TNF-α較空白組明顯升高。用藥12周后,戊酸雌二醇組及骨疏顆粒組血清IL-1β、IL-6及TNF-α均降低,與模型組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。骨疏顆粒防治骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制可能是通過抑制 IL-1β、IL-6及TNF-α分泌,糾正骨吸收不平衡,進(jìn)而減少骨吸收。

表2 各組大鼠血清細(xì)胞因子的比較(±s)

注:與空白組比較,aP＜0.05,bP＜0.01;與模型組比較,cP＜0.05,dP＜0.01

組別 n IL-1β(pg/mL) IL-6(pg/mL) TNF-α(pg/mL) 72.978±7.711 123.032±5.215 245.513±9.589模型組 9 83.797±7.118b128.265±4.394b254.296±13.669a戊酸雌二醇組 8 72.390±4.574d124.463±5.893c246.581±9.480c骨疏顆粒組 10 77.563±9.111c124.374±3.435c246.194±7.021空白組9 c

本課題組臨床觀察發(fā)現(xiàn),骨質(zhì)疏松癥主要病機(jī)為脾腎虧虛,瘀血阻絡(luò)。骨疏顆粒由狗脊30 g、骨碎補(bǔ)15 g、淫羊藿10 g、熟地黃15 g、杜仲20 g、知母10 g、黃芪20 g、白術(shù)10 g、蒼術(shù)10 g、三七粉3 g、羌活10 g、獨(dú)活10 g等組成。方中狗脊、骨碎補(bǔ)、淫羊藿、熟地黃、杜仲、知母補(bǔ)腎壯骨,黃芪、白術(shù)、蒼術(shù)補(bǔ)益脾氣,三七、羌活、獨(dú)活活血通絡(luò)止痛,共湊補(bǔ)腎健脾,活血通絡(luò)止痛之功?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示,淫羊藿總黃酮能有效防止灌服維甲酸造成的大鼠骨量丟失,改善骨組織的顯微結(jié)構(gòu),調(diào)節(jié)骨形成與骨破壞的紊亂狀態(tài),進(jìn)而有效地對(duì)抗骨質(zhì)疏松的發(fā)生[13]。謝雁鳴等[14]研究發(fā)現(xiàn),骨碎補(bǔ)總黃酮能顯著提高大鼠股骨及腰椎的骨密度,調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-6、IL-4及TNF-α的水平。杜仲葉醇提取物具有類激素樣作用,能增進(jìn)大鼠骨髓生成和增加骨質(zhì)強(qiáng)度[15]。黃芪水提液防止去卵巢大鼠骨丟失的效應(yīng)與乙烯雌酚相近,但機(jī)制不同;其不僅能抑制去卵巢后的骨吸收,而且能增加體重[16]。由此可知,骨疏顆粒主要藥物淫羊藿、骨碎補(bǔ)、杜仲、黃芪等均有抗骨質(zhì)疏松作用。本課題組前期臨床研究亦表明[7-8],骨疏顆粒能改善OP的相關(guān)癥狀,抑制骨吸收,減緩骨量丟失,提高腰椎骨密度。本實(shí)驗(yàn)研究顯示,骨疏顆粒可以增加去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠骨密度,與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上,骨疏顆粒對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠有治療作用,其機(jī)制可能是通過降低血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平,抑制骨吸收,從而防治骨質(zhì)疏松癥。

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Effect of Gushu powder on bone m ineral density and serum cytokines in rats w ith osteoporosis follow ing ovriectom y

MAO Hai-qin,DU Yi-bin,XU Ying,etal. Geriatric Department ofFirst Hospital affiliated to Yunnan University of TCM,Kunming 650021,China

DU Yi-bin,E-mail:dybys@126.com

Objective To observe Gushu powder treating rats with ovriectomy osteoporosis,and explore the mechanism of Gushu powder protecting and treating osteoporosis.M ethods According to random number table,forty SD female rats of threemonths were random ly divided into four groups:sham group,model group,estradiol valerate group,and Gushu powder group.The sham group only got shamoperation and the other three groupswere ovriectomized respectively.Three days later after ovriectomy,the rats were given estradiol valerate(0.5 mg/kg) and Gushu powder(10 mL/kg)by intragastric administration for twelve weeks.Bone minereal density(BMD)was detected with dual-energy X-ray absorptiometry.Serum interleukin-1 beta(IL-1β),interleukin-6(IL-6)and tumor necrosis factor alpha(TNF-α)were detected.Results (1)Compared with the sham group,the BMD significantly decreased (P＜0.01),IL-1βand IL-6 significantly increased(P＜0.01),and TNF-αincreased in model group (P＜0.05).(2)Compared with model group,BMD in Bujiale group dramatically increased(P＜0.01), IL-1βsignificantly decreased(P＜0.01),IL-6 and TNF-αdecreased(P＜0.05).While in Gushu powder group,BMD in Bujiale group increased(P＜0.05);IL-1β,IL-6 and TNF-αdecreased(P＜0.05).Conclusions Gushu powdermay prevent and treat osteoporosis through reducing sereum IL-1β,IL-6 and TNF-αwhich can depress bone absorption.

Gushu powder; Osteoporosis; Bone mineral density; Interleukin-1beta; Interleukin-6; Tumor necrosis factor-alpha

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.09.012

2014-07-15)

(本文編輯:董歷華)

云南省教育廳科學(xué)研究基金(2011Y410、2012C034);云南白藥、云南中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)藥教育創(chuàng)新基金(YB2011J06);云南中醫(yī)學(xué)院科研基金(XK201309);云南省中醫(yī)院院級(jí)科研(2011YJ034)

650021昆明,云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院老年病科(杜義斌、毛海琴、李曉燕),科教科(徐瑩),放射科(閔曉黎)

毛海琴(1978-),女,碩士,講師。研究方向:中醫(yī)藥防治風(fēng)濕病。E-mail:mao1978hq@163.com

杜義斌(1968-),本科,主任醫(yī)師,碩士生導(dǎo)師。研究方向:中醫(yī)藥防治老年病。E-mail:dybys@ 126.com