人工誘導(dǎo)葡萄球菌產(chǎn)生耐藥性的研究

曾 森，葉亞瓊，李嘉怡，陳仁貴，婁 華*，朱海琦，李培文，吳志勝，劉霜霜，劉俊杰

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231）

“超級(jí)細(xì)菌”是具有多重耐藥性細(xì)菌的總稱，包括耐青霉素的金黃色葡萄球菌（PRSP）、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（MRSA）、耐萬古霉素腸球菌（VRE）等[1]。葡萄球菌（Staphylococcus）作為化膿性感染、敗血癥或膿毒性敗血癥的主要病原體，常造成奶牛乳腺炎等化膿性或毒素性疾病，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的發(fā)展[2]。耐藥菌是這些年來社會(huì)上的熱議話題之一，特別是MRSA、“超級(jí)”細(xì)菌報(bào)道以來，一度造成社會(huì)上的恐慌，甚至曾有報(bào)道稱：到2050年人類死于耐藥菌的病例將超過癌癥，科學(xué)家們對耐藥菌的研究日益迫切。“超級(jí)”細(xì)菌的耐藥性形成可能與用藥劑量、用藥頻度與寬度（使用藥物的頻率與種類多少）、細(xì)菌的自身變異（物理、化學(xué)、生物性變異）等有關(guān)。細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的原因極可能是細(xì)菌多次與藥物接觸（如抗生素濫用問題），導(dǎo)致細(xì)菌成為耐藥菌。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌的來源與鑒定

葡萄球菌菌株由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院廣東省預(yù)防獸醫(yī)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)平板劃線提純、觀察菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色鏡檢、高鹽甘露醇培養(yǎng)基鑒定，特征與葡萄球菌一致。純化菌株用50%甘油存于-20°C冰箱備用。

1.2 試劑和儀器

藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司，批號(hào)分別為：頭孢唑啉（批號(hào)：S1012）、頭孢他啶（批號(hào)：S1019）、青霉素（批號(hào)：S1001）、苯唑西林（批號(hào)：S1002）、氨芐西林（批號(hào)：S1003）、萬古霉素（批號(hào)：S1054）、氧氟沙星（批號(hào)：S1049）、諾氟沙星（批號(hào)：S1047）、恩諾沙星（批號(hào)：S1081）、新霉素（批號(hào)：S1034）、四環(huán)素（批號(hào)：S1036）、多西環(huán)素（批號(hào)：S1037）；頭孢唑啉標(biāo)準(zhǔn)品購自廣東省藥品檢驗(yàn)所，效價(jià)99.3%；培養(yǎng)基購自廣東省環(huán)凱微生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)用品均在有效期內(nèi)使用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原代葡萄球菌12種抗生素的藥敏試驗(yàn)

按NCCLS（美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)）推薦的Kirby-Bauer瓊脂擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)測定12種抗生素對實(shí)驗(yàn)菌株的敏感程度[3]。挑單個(gè)菌落至液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 hr后，校正菌液濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷岫取＞鶆蛲坎加谄桨灞砻?，然后將紙片貼于瓊脂平板表面，37°C培養(yǎng)18～24 hr后測抑菌圈，選出較敏感藥作為誘導(dǎo)抗生素（頭孢唑啉）。

1.3.2 原代葡萄球菌最小抑菌濃度（MIC值）的測定

用96孔微量肉湯稀釋法測定MIC[5]。挑單個(gè)菌落接于液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24 hr后稀釋10倍制成菌懸液。將頭孢唑啉標(biāo)準(zhǔn)品配成濃度為512 μg/mL的頭孢唑啉藥液，然后倍比稀釋獲得多濃度梯度藥液。將稀釋的藥液與制成的接種懸液按1:9的比例分別加入10個(gè)濃度梯度藥的孔中，藥濃度逐孔遞減；第11孔加100 μL營養(yǎng)肉湯作陰性對照，第12孔加100 μL稀釋的菌懸液作陽性對照，37°C孵育18～24 hr觀察結(jié)果。

1.3.3 頭孢唑啉體外誘導(dǎo)原代葡萄球菌耐藥

根據(jù)MIC的測定結(jié)果，取最小抑菌濃度下一濃度孔的菌液（實(shí)際藥物濃度為0.1 μg/mL），按菌液：頭孢唑啉藥液：普通營養(yǎng)肉湯1:1:8比例混合接種至試管，于37°C培養(yǎng)24 hr，連續(xù)傳代，逐步提升藥液濃度，每隔10～20代測定敏感度。傳至第55代，實(shí)際誘導(dǎo)的藥物濃度為51.2 μg/mL，初步定義為耐藥菌。

1.3.4 耐藥菌耐藥性的測定

1.3.4.1 測定耐藥菌對原來12種抗生素的敏感性

方法參照1.3.1[3]。平板上挑取耐藥菌的單個(gè)菌落至液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 hr后，校正菌液濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)。均勻涂布接種于平板表面，均勻?qū)⒑幖埰N于含菌平板表面，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 hr后測量抑菌圈。

1.3.4.2 測定耐藥菌的最小抑菌濃度（MIC值）

方法參照1.3.2[5]。稀釋的10個(gè)濃度梯度藥液分別加到無菌96孔板中，然后將稀釋的藥液與制成的耐藥菌接種懸液按1:9的比例分別加入10個(gè)濃度梯度的10孔中，藥物濃度逐孔遞減，濃度最高為51.2 μg/mL；第11孔加100 μL普通營養(yǎng)肉湯作為陰性對照，第12孔加100 μL稀釋后的耐藥菌接種懸液作為陽性對照，37°C培養(yǎng)18～24 hr觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 耐藥葡萄球菌形態(tài)學(xué)變化

耐藥菌株普通營養(yǎng)瓊脂平板菌落細(xì)小，稍白；耐藥菌株在甘露醇NaCl瓊脂平板上平板顏色淺黃，形態(tài)與原代菌一致。加頭孢唑啉藥液培養(yǎng)的菌液革蘭氏染色油鏡鏡檢形態(tài)松散，黏著度低，極少或不形成葡萄串狀。菌落革蘭氏染色油鏡鏡檢與典型葡萄球菌形態(tài)一致。

2.2 原代與耐藥葡萄球菌12種抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)變化

多次藥敏試驗(yàn)結(jié)果，原代葡萄球菌對12種抗生素均敏感，誘導(dǎo)的耐藥菌株對所測的β-內(nèi)酰胺類藥物的完全耐藥，同時(shí)發(fā)現(xiàn)耐藥菌對所測非β-內(nèi)酰胺類原先敏感的藥物的敏感度增加。見表1。

表1 原代菌株與耐藥菌株抑菌圈數(shù)據(jù)記錄及12種抗生素抑菌圈解釋標(biāo)準(zhǔn)

2.3 原代與耐藥葡萄球菌最小抑菌濃度（MIC值）測定結(jié)果及變化

測定MIC的實(shí)驗(yàn)菌株設(shè)為第一代，第二代開始用頭孢唑啉對菌株體外人工誘導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)，每次提升藥物濃度，實(shí)驗(yàn)菌株逐步適應(yīng)環(huán)境，生長速度由慢變快。傳至第55代，實(shí)際藥物濃度為51.2 μg/mL，獲得完全耐藥的葡萄球菌菌株。測得頭孢唑啉對耐藥菌株的MIC值，見表2。

表2 頭孢唑啉對耐藥菌和原代菌的MIC結(jié)果及頭孢唑啉MIC的解釋標(biāo)準(zhǔn)

3 討 論

目前研究一般認(rèn)為“超級(jí)”細(xì)菌的耐藥性形成可能與用藥劑量、用藥頻度與寬度（使用藥物的頻率與種類的多少）、細(xì)菌的自身變異（物理、化學(xué)、生物性的變異）等有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過55代的體外多步傳代誘導(dǎo)，成功誘導(dǎo)出耐藥葡萄球菌。在自然環(huán)境下，細(xì)菌長期接觸低劑量的一種或多種抗生素的可能性是比較小的。說明葡萄球菌在自然環(huán)境下對頭孢唑啉是不太容易產(chǎn)生耐藥性的。本方法所需儀器設(shè)備少，能較好解決操作難度和成本的問題且誘導(dǎo)效率、準(zhǔn)確率和成功率比較好。本實(shí)驗(yàn)方法申請的發(fā)明專利申請已經(jīng)受理。

本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的耐藥菌株對所測β-內(nèi)酰胺類抗生素均由敏感變成完全耐藥、對所測非β-內(nèi)酰胺類抗生素敏感度增加，喹諾酮類抗生素氧氟沙星、諾氟沙星和恩諾沙星的抑菌圈分別從30、24、26 mm升至35、30、35 mm，四環(huán)素類抗生素四環(huán)素和多西環(huán)素的抑菌圈分別從26、21 mm升至35、30 mm，氨基糖苷類抗生素新霉素的抑菌圈從19 mm升至33 mm，糖肽類抗生素萬古霉素的抑菌圈從16 mm升至23 mm。其中新霉素的抑菌圈增加最多，敏感度升高最為明顯，其次是恩諾沙星和四環(huán)素。

根據(jù)目前的研究，耐藥性機(jī)制分為：細(xì)菌產(chǎn)生滅活酶或鈍化酶，破壞抗生素的結(jié)構(gòu)，使其失去活性；改變抗生素作用的靶位蛋白結(jié)構(gòu)和數(shù)量，使細(xì)菌對抗生素不再敏感；細(xì)菌細(xì)胞膜滲透性改變，使抗生素不能進(jìn)入菌體內(nèi)部；細(xì)菌主動(dòng)藥物外排泵作用，將抗生素排出菌體；細(xì)菌生物被膜的形成，降低抗生素作用等[1-9]。而該耐藥菌的耐藥機(jī)制及對非β-內(nèi)酰胺類抗生素敏感度增加的原因尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

通過本實(shí)驗(yàn)說明低劑量藥物多次體外誘導(dǎo)可以誘導(dǎo)葡萄球菌產(chǎn)生對β-內(nèi)酰胺類抗生素的完全耐藥；但該耐受菌株卻大大增加了對其他類抗生素的敏感性。同時(shí)在此呼吁臨床應(yīng)合理使用抗生素。