水體敵百蟲污染的植物修復及其生理生化特性研究

劉 浩，趙旭德，劉夢琳，李勝方，王啟爍，陶 敏，*

(1湖北理工學院環(huán)境科學與工程學院，湖北黃石435003;2湖北理工學院礦區(qū)環(huán)境污染控制與修復湖北省重點實驗室，湖北黃石435003;3中國科學院水生生物研究所，湖北武漢430072)

0 引言

上世紀80年代末，由于有機磷農藥(Organophosphate Pesticides，OPPs)具有藥效高、應用廣泛、種類繁多、易降解、殘留毒素較低等特點，逐步取代了大范圍使用的有機氯農藥，成為全球使用范圍最為普遍的一種殺蟲劑［1］。然而，OPPs 并非如人們想象的那么安全，它也可能在環(huán)境中蓄積，對環(huán)境生態(tài)造成較大的損害。近年來，隨著對OPPs 環(huán)境化學行為和環(huán)境毒理性質研究的不斷深入，人們逐漸意識到OPPs 在給農業(yè)生產(chǎn)帶來收益的同時也帶來了一定的隱憂，一些難降解、脂溶性強的有機農藥通過水循環(huán)和食物鏈富集發(fā)生遷移轉化，長期食用含有這些農藥殘留的水產(chǎn)品可致畸、致癌，對人類健康造成嚴重威脅［2－4］。因此，如何高效安全地處理含有機磷農藥的污水或受污染水體對生態(tài)環(huán)境和人類健康有著非常重要的意義。

敵百蟲(O，O－二甲基－(2，2，2－三氯－1－羥基乙基)膦酸酯)是1952年德國拜耳公司開發(fā)的一種中毒、高效、廣譜有機磷殺蟲劑，它廣泛應用于水產(chǎn)上的殺蟲和消毒［5－6］。盡管敵百蟲作為中低毒農藥推薦使用，但其在弱堿性條件下可脫去一分子氯化氫而形成毒性增大約10 倍的敵敵畏，具有誘發(fā)染色體變異作用，存在致癌的危害。據(jù)研究表明，長期處于敵百蟲的暴露下，魚體內的對氧磷酶、乙酰膽堿酯酶的活性顯著降低，導致魚體受損和生理機能下降［7］。敵百蟲還可引起細胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡，細胞內質網(wǎng)發(fā)生應激反應，并誘導細胞凋亡［8］。

目前，國內外有機磷農藥污染修復的方法主要有物理法(超聲波技術、吸附、洗滌和電離輻射等)［9－10］、化學法(水解、氧化分解和光化學降解等)［11－12］和生物降解法(植物修復、微生物修復、降解酶和工程菌降解等)［13－15］。其中，植物修復(Phytoremediation)技術具有投入低、治理效果明顯、不易產(chǎn)生副作用、可恢復和建設生態(tài)環(huán)境的特點，已經(jīng)成為環(huán)境污染治理的焦點和熱點［16］。有研究［17－18］表明，鳳眼蓮、苜蓿、香蒲等植物能夠有效地去除水體中的PAHs、DDT、馬拉硫磷、三唑磷等。另外，植物可通過釋放水解酶、過氧化物酶等胞外酶直接降解多氯聯(lián)苯和酚類有機物［19］，或通過分泌有機酸和酚類物質刺激微生物活性，間接促進有機物降解［20］。可見，利用植物修復技術不僅能起到凈化水體的作用，還能夠改善水體生態(tài)環(huán)境。

本文以有機磷農藥敵百蟲為試驗對象，研究美人蕉、菖蒲和鳳眼蓮3 種水生、濕生植物對水體有機磷農藥的降解效果，篩選出修復效果好、經(jīng)濟實用的植物;并探討了不同敵百蟲濃度脅迫下水生植物的生理生化特性變化，從有機物降解酶活性方面揭示有機磷農藥降解的生物學機制，為植物修復水體有機磷農藥污染提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗系統(tǒng)

本試驗系統(tǒng)由12 個5 L 的容器組成，依次編號為1，2，3，…，10，11，12。在編號1，2，3 的容器中均放入2 L 以磁湖污水配置的敵百蟲溶液，敵百蟲濃度分別為3 mg/L、15 mg/L、30 mg/L，然后將經(jīng)過預培養(yǎng)生長良好的美人蕉移入系統(tǒng)中，每組3 棵左右。編號4，5，6 和7，8，9 容器的操作步驟同上，所不同的是移入的植物分別為鳳眼蓮和菖蒲。編號10，11，12的容器為無植物空白對照組，其他條件一致，所有試驗組均在臨窗自然光條件下培養(yǎng)，試驗系統(tǒng)示意圖如圖1所示。試驗系統(tǒng)中水體理化指標分別為:pH 7.90、DO 3.27 mg/L、COD 85.3mg/L、TN 5.78 mg/L、TP 0.21 mg/L。試驗時間為2013年9月至2013年10月，分別采集試驗前和試驗結束后的各系統(tǒng)中植物的根部，用蒸餾水清洗干凈后，迅速放入冰箱中低溫保存(－4 ℃);另外，試驗結束后采集各系統(tǒng)中的水樣，測定水溶液中敵百蟲的殘余量。

圖1 試驗系統(tǒng)示意圖

1.2 水體中敵百蟲含量的測定

敵百蟲的含量采用自動電位滴定儀進行測定，即準確量取敵百蟲樣品溶液100 mL，置于250 mL 錐形瓶中，加入40 mL 乙醇溶液，置于30 ±0.5 ℃的恒溫水浴中，靜置10 min，加入5 mL 碳酸鈉溶液，放置10 min 后立即緩慢加入10 mL 硝酸溶液，然后從恒溫水浴中取出，將溶液轉入250 mL 燒杯中，用硝酸銀標準滴定溶液進行電位滴定。最后，按照以下公式計算樣品中敵百蟲的含量:

式(1)中:W(敵百蟲)為敵百蟲樣品溶液中的質量分數(shù)，%;C 為硝酸銀標準滴定溶液的濃度，mol/L;V 為試樣測定時消耗硝酸銀標準滴定溶液的體積，mL;V0為空白測定時消耗硝酸銀標準滴定溶液的體積，mL;C樣為試樣溶液中敵百蟲初始濃度，g/mL;C0為空白試樣溶液中敵百蟲初始濃度，g/mL;0.01 為量取的試樣溶液的體積，mL;0.257 4 為敵百蟲分子的毫摩爾質量，g/mmol;1.01 為校正系數(shù)。

1.3 植物酶活性的測定

1.3.1 SOD 活性測定

SOD 活性測定采用氮藍四唑法，即稱取植物根部0.5 g，先加入2.5 mL PBS，研磨勻漿后，再加入2.5 mL PBS 混勻，－4 ℃下10 000 r/min 離心15 min，上清液即為粗酶液。取部分上清液經(jīng)適當稀釋后用于酶活性測定。取10 mL 小燒杯7 只，其中3 只用作測定樣品，4 只作為對照。SOD 活性測定所用試劑及其用量如表1所示，按照表1 中的用量加入試劑。

將上述試劑混勻后，1 只對照燒杯置于暗處，另3 只對照燒杯和樣品一起置于4 000 lx日光燈下反應20 min(要求各管受光一致，溫度高時時間縮短，溫度低時可適當延長時間)，最后在560 nm 處測定反應液的光密度。以不照光的對照燒杯作參比，分別測定其他各管的光密度。按照下式計算SOD 活性:

式(2)中，SOD 總活性以U/gFW 表示;ACK為對照燒杯(照光)的光吸收值;AE 為樣品的光吸收值;V 為樣液總體積;Vt 為測定時樣品用量;W 為樣重，g。

表1 SOD 活性測定所用試劑及其用量

1.3.2 POD 活性測定

POD 活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，即稱取植物根部0.25 g，加入5 倍量(m /v)的pH7.0 PBS，冰浴研磨，15 000 r/min 離心15 min，取部分上清液經(jīng)適當稀釋后用于酶活性測定。在3 mL 的反應體系中，加入0.3% H2O21 mL、0.2%愈創(chuàng)木酚0.95 mL，pH7.0 PBS 1 mL，最后加入0.05 mL 酶液啟動反應，記錄470 nm 處OD 增加速度。將每分鐘OD 增加0.01 定義為1 個活力單位，以U/gFW 表示。

1.3.3 MDA 含量的測定

丙二醛(MDA)的測定采用硫代巴比妥酸法，即取0.5 g 植物樣品，先加入10% TCA 2 mL 研磨勻漿后再加入3 mL TCA 進一步研磨，研磨后所得勻漿在3 000 r/min 下離心10 min，取上述步驟所得的上清液2.0 mL 于帶塞試管中(可做2 個重復)，加入0.5% TBA 溶液2.0 mL，混合后于沸水浴上反應20 min，迅速冷卻后離心，上清液分別于532 nm、600 nm 及450 nm 波長下測定OD 值。對照管以2 mL 水代替提取液。按照MDA 濃度C(μmol/L)= 6.45(OD532－OD600)－0.56OD450計算MDA 含量，然后以植物鮮重表示丙二醛含量:MDA(μmol/gFW)。

2 結果與討論

2.1 3 種植物對不同濃度敵百蟲的去除率

3 種植物對不同濃度敵百蟲的去除率如圖2所示。從圖2 可以看出，無植物空白系統(tǒng)中敵百蟲有一定的降解，這可能是由于水體的弱堿環(huán)境(pH =7.90)導致敵百蟲轉化為敵敵畏的緣故。美人蕉和鳳眼蓮對敵百蟲的去除率明顯高于空白系統(tǒng)，而菖蒲對敵百蟲的去除較空白系統(tǒng)有一定的提高。在不同濃度敵百蟲的脅迫下，3 種植物對敵百蟲的去除效果均表現(xiàn)出相同的趨勢，即美人蕉＞鳳眼蓮＞菖蒲。成水平等［21］研究發(fā)現(xiàn)美人蕉對水體三唑磷的去除率為41% 左右，本試驗條件下美人蕉對敵百蟲的去除率為50.3% ～63%，去除效果較好。此外，敵百蟲初始濃度為3 mg/L時，3 種植物均對水體敵百蟲的去除率最高，隨著敵百蟲初始濃度的升高，植物對其去除率逐步降低，這可能是由于過高的敵百蟲濃度會抑制植物根部降解酶的活性以及影響植物根際的礦化作用所致［22］。

圖2 3 種植物對不同濃度敵百蟲的去除率

2.2 不同濃度敵百蟲對植物MDA 含量的影響

MDA 的濃度常用來表示脂質過氧化強度和膜系統(tǒng)的受傷害程度，是反映植物抗逆境強弱的生理指標［23］。不同濃度敵百蟲對3 種植物根部MDA 含量的影響如圖3所示，從圖3中可以看出，在不同濃度敵百蟲的脅迫下，3種植物根部MDA 的含量均有不同程度的升高;其中菖蒲根部MDA 含量增長最快，從0.056 μmol/gFW 增長到0.247 μmol/gFW，但是鳳眼蓮和美人蕉根部MDA 的含量都不隨著敵百蟲濃度的升高而增大?？梢?，不同濃度敵百蟲脅迫下，鳳眼蓮和美人蕉根部膜系統(tǒng)受傷害程度不大，而菖蒲則表現(xiàn)出較差的抗逆境生理特性。另外，從圖3 中還可發(fā)現(xiàn)，美人蕉根部MDA 含量是3 種植物中最低的，表明敵百蟲脅迫下美人蕉受到的損傷最小，即美人蕉保持正常生理代謝活動的能力較強，這也正是美人蕉對敵百蟲去除效果較好的原因。

圖3 不同濃度敵百蟲對植物根部MDA 含量的影響

2.3 不同濃度敵百蟲對植物SOD 活性的影響

SOD 是植物細胞內普遍存在的一種重要的抗氧化酶，有助于植物清除氧自由基，其活性大小反映植物的抗逆性能力。不同濃度敵百蟲對植物根部SOD 活性的影響如圖4所示，由圖4可知，在敵百蟲脅迫下，3 種植物根部SOD 酶的活性都表現(xiàn)出不同程度的上升，其中鳳眼蓮和美人蕉根部SOD 酶的活性均在敵百蟲低濃度脅迫時較大，表現(xiàn)出較強的抗逆性能力，而在高濃度脅迫下其抗逆性都有一定的降低。可見，在敵百蟲有機磷農藥脅迫下，植物通過調節(jié)SOD 酶活性阻止細胞受到氧自由基的侵害，在一定程度上增強了植物對逆境的耐受性;但是SOD 酶對植物的保護作用是有限的，當敵百蟲的脅迫超出植物的耐受范圍時，反而會對植物根部SOD 的活性產(chǎn)生抑制作用［24］。

圖4 不同濃度敵百蟲對植物根部SOD 活性的影響

2.4 不同濃度敵百蟲對植物POD 活性的影響

POD 是清除活性氧H2O2的重要保護酶類，能將H2O2分解為O2和H2O，從而降低H2O2對植物的毒害。不同濃度敵百蟲對植物根部POD 活性的影響如圖5所示，由圖5 可知，鳳眼蓮根部POD 的活性最高，其次是美人蕉，而菖蒲根部POD 的活性最小。鳳眼蓮根部POD 酶的活性隨著敵百蟲濃度的升高表現(xiàn)出明顯的下降趨勢，表明敵百蟲農藥對鳳眼蓮的正常生理代謝產(chǎn)生了顯著的脅迫作用，使其對外界的抵抗力下降。在低濃度敵百蟲脅迫下，菖蒲根部POD 的活性有一定的升高，但當敵百蟲濃度高于3 mg/L 時，菖蒲根部POD 的活性迅速降為0，說明敵百蟲對菖蒲根部造成了嚴重損害。美人蕉根部POD 的活性隨著敵百蟲濃度的升高幾乎不變，這表明美人蕉根部受到敵百蟲的脅迫不明顯。

圖5 不同濃度敵百蟲對植物根部POD 活性的影響

3 結論

1)在不考慮蒸發(fā)量影響的情況下，3 種水生植物均促進了水體中敵百蟲的降解，鳳眼蓮、菖蒲、美人蕉對敵百蟲的平均去除率較無植物系統(tǒng)分別提高了21.55%、10.04%、33.83%，其修復能力大小依次為美人蕉＞鳳眼蓮＞菖蒲。因此，在選擇水生植物修復水體有機磷農藥敵百蟲時，應優(yōu)先考慮美人蕉。

2)不同濃度敵百蟲對3 種水生植物根部的生理生化特征均有一定的影響，低濃度時可誘導植物根部解毒酶活性的增強，而較高濃度時植物正常生理代謝受到了抑制。在敵百蟲脅迫下，美人蕉根部MDA 的含量是3 種植物中最低的，SOD 的活性在3 種植物中最高，表明美人蕉受到的損傷最小，具有較強的抗逆性能力。

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