血紅素加氧酶-1過表達對急性壞死性胰腺炎大鼠的保護作用

張飛虎　孔立　董曉斌　韓寧　趙浩　范開亮　毛恩強　湯耀卿　張圣道

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血紅素加氧酶-1過表達對急性壞死性胰腺炎大鼠的保護作用

張飛虎孔立董曉斌韓寧趙浩范開亮毛恩強湯耀卿張圣道

目的應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染方法上調(diào)血紅素加氧酶-1(HO-1)基因表達，觀察其對急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺的保護作用，探討其作用機制。 方法63只SD雄性大鼠采用5%?；悄懰徕c逆行胰管內(nèi)注射法制備ANP模型。按數(shù)字表法將ANP大鼠隨機分為ANP組、腺病毒空載組、腺病毒基因組，每組21只。ANP組大鼠制模后30 min腹腔注射生理鹽水1 ml；腺病毒空載組注射Adv-0 2.0×109pfu/ml；腺病毒基因組注射Adv-HO-1 2.0×109pfu/ml。Adv-0和Adv-HO-1由上海東方肝膽外科醫(yī)院病毒與基因治療中心完成。每組大鼠15只觀察72 h生存情況；6只于制模后20 h處死，取血檢測血HO-1、IL-10、TNF-α含量，取胰腺組織常規(guī)病理學檢查，實時PCR法檢測胰腺組織HO-1、IL-10、TNF-α mRNA表達量。 結(jié)果制模后20 h，ANP組、腺病毒空載組、腺病毒基因組大鼠血清HO-1含量分別為(0.90±0.09)、(0.89±0.07)、(1.29±0.07)μg/L，IL-10含量為(85.68±5.61)、(81.11±2.48)、(120.93±8.07)ng/L，TNF-α含量為(47.77±6.54)、(50.08±6.60)、(28.07±2.98)ng/L；胰腺組織HO-1 mRNA表達量分別為160.44±11.47、158.23±10.51、237.25±12.09，IL-10 mRNA表達量為33.93±2.56、34.13±3.01、60.02±2.89，TNF-α mRNA表達量為25.23±2.37、25.03±2.07、13.12±1.77。腺病毒基因組HO-1、IL-10含量及mRNA表達量均較腺病毒空載組和ANP組顯著升高，TNF-α含量及mRNA表達量較腺病毒空載組、ANP組顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)；腺病毒空載組與ANP組的差異均無統(tǒng)計學意義。制模后72 h，ANP組、腺病毒空載組、腺病毒基因組大鼠生存率分別為6.67%、0、46.67%，腺病毒基因組較腺病毒空載組及ANP組均顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)；腺病毒空載組與ANP組間的差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染方法上調(diào)HO-1表達對ANP大鼠胰腺具有保護作用，其機制可能是通過上調(diào)IL-10表達和抑制TNF-α表達實現(xiàn)的。

胰腺炎，急性壞死性；血紅素加氧酶-1；轉(zhuǎn)染；腫瘤壞死因子-α；白介素-10

Fund program: National Natural Science Foundation of China(81503543); Natural Science Foundation of Shandong Provincial(2015ZRB14327)

隨著對細胞因子研究的深入，人們認識到細胞因子過度釋放是重癥急性胰腺炎(SAP)發(fā)病及導致病情加重的主要根源，且過度放大的炎癥反應(yīng)使SAP的發(fā)病不僅局限于胰腺本身，往往累及全身多個臟器。在炎癥反應(yīng)早期，中性粒細胞、單核巨噬細胞及局部組織釋放的促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)等進入血液循環(huán)導致全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)和多器官功能障礙綜合征(MODS)[1]。因此，如何在SAP早期有效地控制機體炎癥反應(yīng)的過度放大成為提高SAP整體存活率的重要環(huán)節(jié)。血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是一種應(yīng)激誘導的熱休克蛋白，是降解血紅素為一氧化碳(CO)、膽綠素和亞鐵的限速酶。既往研究[2-4]提示，HO-1可通過抗氧化、抗炎癥反應(yīng)和維持微循環(huán)正常功能等機制在應(yīng)激狀態(tài)下保護細胞。因此，有效維持HO-1高表達對于SAP機體應(yīng)該具有保護作用。本研究旨在探討SAP應(yīng)激狀態(tài)下，應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺HO-1表達，觀察其對胰腺組織病理損傷的影響及調(diào)控促炎和抗炎細胞因子的作用。

材料及方法

一、材料與試劑

6～7周齡的SPF級健康雄性SD大鼠63只購于中科院上海實驗動物中心，體重220～260 g。應(yīng)用免疫缺陷型人5腺病毒(Adenoviral destination vector，Adv)作為載體構(gòu)建插入HO-1基因的腺病毒載體(Adv-HO-1)，由上海東方肝膽外科醫(yī)院病毒與基因治療中心協(xié)助完成。

純度>95%的?；悄懰徕c(貨號86339)購自Sigma公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號A3500)購自Promega公司，熒光定量PCR Premix試劑盒(貨號A2010A0112)購自BioTNT公司，HO-1、IL-10、TNF-α ELISA試劑盒(貨號E0548r、E0056r、E0133r)均購自EIAabTM公司。

二、研究方法

1．動物模型建立與實驗分組：63只大鼠均采用5%?；悄懰徕c0.1 ml/100 g體重逆行胰管內(nèi)注射法制備ANP模型，術(shù)后大鼠自由飲水。按數(shù)字表法將ANP大鼠隨機分為ANP組、腺病毒空載組、腺病毒基因組，每組21只。制模后30 min ANP組大鼠腹腔注射生理鹽水1 ml，腺病毒空載組注射Adv-0 2.0×109pfu/ml，腺病毒基因組注射Adv-HO-1 2.0×109pfu/ml。每組15只大鼠用于觀察72 h的生存情況。其余6只于制模后20 h應(yīng)用乙醚進行麻醉，腹主動脈取血，分離血清，置-20℃儲存?zhèn)溆?；取部分胰腺組織置10%甲醛溶液中固定，部分組織置液氮保存。

2．胰腺組織病理學檢查：取固定的胰腺組織，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色，由上海交通大學醫(yī)學院病理教研室教員讀片，并按Schmidt等[5]標準進行胰腺組織病理評分。

3．血清HO-1、TNF-α、IL-10含量檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測血清HO-1、TNF-α、IL-10含量。

4．胰腺組織HO-1、TNF-α、IL-10 mRNA表達檢測：取液氮保存的胰腺組織，研磨成粉狀后采用Trizol提取組織總RNA，先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后應(yīng)用熒光定量PCR法檢測HO-1、TNF-α、IL-10 mRNA表達。引物序列及PCR退火溫度見表1。PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min、退火溫度20 s、72℃ 30 s，40個循環(huán)。由儀器自帶軟件獲得Ct值，以公式2-ΔΔCt計算mRNA相對表達量。

為了快速定位中壓、低壓配電網(wǎng)中的故障,本文根據(jù)停電事件的觸發(fā)類型、多源信息之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系,研究了基于多源數(shù)據(jù)的停電故障研判方法,并通過停電事件信息池的設(shè)計,用以加快停電故障的研判以及在多個應(yīng)用之間的共享。

三、統(tǒng)計學處理

結(jié)　　果

一、血清HO-1、IL-10、TNF-α含量變化

制模后20 h，ANP組、腺病毒空載組、腺病毒基因組大鼠血清HO-1含量分別為(0.90±0.09)、(0.89±0.07)、(1.29±0.07)μg/L；IL-10含量為(85.68±5.61)、(81.11±2.48)、(120.93±8.07)ng/L；TNF-α含量為(47.77±6.54)、(50.08±6.60)、(28.07±2.98)ng/L。腺病毒基因組血HO-1、IL-10含量較腺病毒空載組及ANP組均顯著升高，TNF-α含量較腺病毒空載組及ANP組顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為6.847、6.172；9.112、8.674；-11.375、-10.784；P值均<0.05)；腺病毒空載組與ANP組間的差異均無統(tǒng)計學意義。

二、胰腺組織HO-1、IL-10、TNF-α mRNA表達量變化

制模后20 h，ANP組、腺病毒空載組、腺病毒基因組大鼠胰腺組織HO-1 mRNA表達量分別為160.44±11.47、158.23±10.51、237.25±12.09；IL-10 mRNA表達量為33.93±2.56、34.13±3.01、60.02±2.89；TNF-α mRNA表達量為25.23±2.37、25.03±2.07、13.12±1.77。腺病毒基因組HO-1、IL-10 mRNA表達量較腺病毒空載組及ANP組顯著升高，TNF-α mRNA表達量較腺病毒空載組及ANP組顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為7.746、7.254；10.957、11.382；-10.497、-10.976；P值均<0.05)；腺病毒空載組與ANP組間的差異均無統(tǒng)計學意義(t值分別為-0.196,0.231，-0.094，P值均>0.05)。

ANP組大鼠胰腺組織鏡下見局部出血、壞死以及中性粒細胞浸潤；腺病毒空載組大鼠胰腺病變與ANP組無明顯差異；腺病毒基因組大鼠胰腺病理損傷較ANP組減輕，中性粒細胞浸潤較少，腺管結(jié)構(gòu)完整(圖1)。ANP組、腺病毒空載組、腺病毒基因組大鼠胰腺組織病理評分分別為(11.3±1.4)、(11.8±1.3)、(8.5±0.9)分，腺病毒基因組較腺病毒空載組及ANP組均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為-5.495，-5.246，P值均<0.05)，而腺病毒空載組與ANP組間差異無統(tǒng)計學意義(t=0.247，P>0.05)。

表1　各基因引物序列及退火溫度

圖1　制模后20 h ANP組(1A)、腺病毒空載組(1B)、腺病毒基因組大鼠胰腺病理改變(HE　×200)

四、各組大鼠生存情況

腺病毒基因組制模后24、48、72 h的大鼠生存率分別為86.67%、66.67%、46.67%；腺病毒空載組分別為53.33%、20.00%、0；ANP組分別為60.00%、13.33%、6.67%。腺病毒基因組大鼠生存率較腺病毒空載組及ANP組均顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)；腺病毒空載組與ANP組間的差異無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。

討　　論

HO-1也稱為熱休克蛋白-32(heat shock protein-32，HSP-32)，是一種應(yīng)激誘導的蛋白，是降解血紅素為膽綠素、CO和亞鐵的限速酶。重金屬、血紅素、一氧化氮(NO)、生長因子、細胞因子、低氧、高氧等均可誘導HO-1表達[6]。既往研究[2-4]提示，應(yīng)激狀態(tài)下HO-1通過抗氧化、抗炎癥反應(yīng)及維持微循環(huán)正常功能等機制保護細胞。急性胰腺炎發(fā)病后，多種應(yīng)激因素可引起氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因表達上調(diào)，尤其以HO-1基因表達上調(diào)最為顯著[7]，表明機體具有對抗應(yīng)激反應(yīng)的代償機制。但胰腺局部病變并未因此減輕或停止，原因在于對抗炎癥反應(yīng)的抗炎細胞因子表達難以拮抗和抑制大量釋放的促炎細胞因子表達。因此通過外源性措施提高HO-1表達能夠降低促炎細胞因子的釋放，以達到保護臟器功能的作用。

基因轉(zhuǎn)染的方法可使目的基因長時間表達，從而調(diào)節(jié)細胞因子的免疫反應(yīng)，在炎癥疾病的治療中越來越受到重視。腺病毒是一種雙鏈DNA病毒，其基因組為36 000 bp，可有效感染分裂期及非分裂期細胞；且宿主廣泛，對胰腺、肝臟、腎臟及肺臟組織均有較強的組織親嗜性[8-10]，并且以腺病毒作為載體可使目的基因有較高水平表達[11]。腹膜表面積大，血管豐富，且無DNA酶的降解作用，是腺病毒感染較好的部位，從而使目的基因可有較長時間的轉(zhuǎn)錄和表達，且不影響病變部位的治療效果[12]，所以腹腔內(nèi)注射是腺病毒感染的常用方法。Abraham等[13]報道，HO-1基因治療在高血壓、心肌病、器官移植、肺臟疾病及內(nèi)毒素血癥等的方面已取得顯著成就。

本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用腺病毒載體使ANP大鼠胰腺組織HO-1高表達，能夠減輕胰腺組織病變程度，提高大鼠生存率。說明HO-1對胰腺組織損傷具有保護作用。

SAP發(fā)生、發(fā)展過程中有多種抗炎和促炎細胞因子的參與，TNF-α和IL-10分別是體內(nèi)重要的促炎和抗炎細胞因子。TNF-α是由激活的淋巴細胞、巨噬細胞分泌的促炎細胞因子，其在SAP的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要的作用[14]，TNF-α升高可誘導IL-8、IL-6及其自身表達的升高，從而引起級聯(lián)反應(yīng)，造成炎癥遞質(zhì)的失控性釋放[15]。IL-10主要由Th-2細胞產(chǎn)生，具有潛在的抗炎功能，可抑制IL-2、IL-3及TNF-α等促炎細胞因子的合成與釋放，對SAP所致的多器官損傷具有改善作用[16-17]。SAP發(fā)生后，胰腺內(nèi)的巨噬細胞首先釋放出TNF-α等促炎細胞因子導致胰腺局部病變惡化，同時機體也開始釋放IL-10等抗炎細胞因子。但抗炎因子難以阻止全身過度炎癥反應(yīng)和胰腺局部壞死而發(fā)生膿毒癥休克，從而引發(fā)肝臟等遠隔器官的細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6等)表達升高，并進展為MODS。在SAP早期提高IL-10等抗炎細胞因子表達和抑制TNF-α等促炎細胞因子表達可緩解或阻斷胰腺的局部病變，提高生存率[18-20]。

本研究結(jié)果顯示，ANP大鼠血HO-1含量和胰腺組織HO-1 mRNA表達升高，血IL-10含量和胰腺組織IL-10 mRNA表達也明顯升高，而血TNF-α含量和胰腺組織TNF-α mRNA表達均顯著降低。由此推論，HO-1對ANP大鼠臟器保護作用可能是通過提高抗炎細胞因子IL-10表達和抑制促炎細胞因子TNF-α表達所實現(xiàn)的。

[1]Yasar M, Uysal B, Kaldirim U, et al. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition modulates experimental acute necrotizing pancreatitis-induced oxidative stress, bacterial translocation and neopterin concentrations in rats[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2010, 235(9):1126-1133. DOI: 10.1258/ebm.2010.010091.

[2]Scott JR, Cukiemik MA, Ott MC, et al. Low-dose inhaled carbon monoxide attenuates the remote intestinal inflammatory response elicited by hindlimb ischemia-reperfusion[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2009, 296(1):G9-G14. DOI: 10.1152/ajpgi.90243.2008.

[3]Wang CF, Wang ZY, Li JY. Dual protective role of HO-1 in transplanted liver grafts: a review of experimental and clinical studies[J]. World J Gastroenterol, 2011, 17(26):3101-3108. DOI: 10.3748/wjg.v17.i26.3101.

[4]Tamion F, Richard V, Renet S, et al. Protective effects of heme-oxygenase expression against endotoxic shock: inhibition of tumor necrosis factor-alpha and augmentation of interleukin-10[J]. J Trauma, 2006, 61(5):1078-1084. DOI: 10.1097/01.ta.0000239359.41464.ef.

[5]Schmidt J, Rattner DW, Lewandrowshi K, et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy[J]. Ann Surg, 1992, 215(1):44-56.

[6]Castilho A, Aveleira CA, Leal EC, et al. Heme oxygenase-1 protects retinal endothelial cells against high glucose-and oxidative/nitrosative stress-induced toxicity[J]. PLoS One, 2012, 7(8):e42428. DOI: 10.1371/journal.pone.0042428.

[7]Saruc M, Yuceyar H, Turkel N, et al. The role of heme in hemolysis-induced acute pancreatitis[J]. Med Sci Monit, 2007, 13(3):BR67-BR72.

[8]Vallabhaneni R, Kaczorowski DJ, Yaakovian MD, et al. Heme oxygenase 1 protects against hepatic hypoxia and injury from hemorrhage via regulation of cellular respiration[J]. Shock, 2010, 33(3):274-281. DOI: 10.1371/journal.pone.0042428.

[9]An L, Liu CT, Yu MJ, et al. Heme oxygenase-1 system, inflammation and ventilator-induced lung injury[J]. Eur Pharmacol, 2012, 677(1-3):1-4. DOI: 10.1016/j.ejphar.2011.12.010.

[10]Van-Assche T, Huygelen V, Crabtree MJ, et al. Gene therapy targeting inflammation in atherosclerosis[J]. Curr Pharm Des, 2011, 17(37):4210-4223.

[11]Mullan B, Dugue C, Moutard V, et al. Robust functional gene validation by adenoviral vectors: one-step Escherichia coli-derived recombinant adenoviral genome construction[J]. Gene Ther, 2004, 11(21):1599-1605. DOI:10.1038/sj.gt.3302333.

[12]Evans JM, Navarro S, Doki T, et al. Gene transfer of heme oxygenase-1 using an adeno-associated virus serotype 6 vector prolongs cardiac allograft survival[J]. J Transplant, 2012, 2012:740653. DOI: 10.1155/2012/740653.

[13]Abraham NG, Asija A, Drummond G, et al. Heme oxygenase-1 gene therapy: recent advances and therapeutic applications[J]. Curr Gene Ther, 2007, 7(2): 89-108. DOI: 10.2174/156652307780363134.

[14]Bishehsari F, Sharma A, Toth C, et al. TNF-alpha gene (TNFA) variants increase risk for muti-origan dysfunction syndrome (MODS) in acute pancreatitis[J]. Pancreatology, 2012, 12(2):113-118. DOI: 10.1016/j.pan.2012.02.014.

[15]Malleo G, Mazzon E, Siriwardena AK, et al. Role of tumor necrosis factor-alpha in avute pancreatitis: from biological basia to clinical evidence[J]. Shock, 2007, 28(2):130-140. DOI: 10.1097/shk.0b013e3180487ba1.

[16]Keceli M, Kucuk C,Sozuer E, et al. The effect of interleukin-10 on acute pancreatitis induced by cerulein in a rat experimental model[J]. J Invest Surg, 2005, 18(1):7-12. DOI:10.1080/08941930590905080.

[17]Chen ZQ, Tang YQ, Zhang Y, et al. Adenoviral transfer of human interleukin-10 gene in lethal pancreatitis[J]. World J Gastroenterol, 2004, 10(20):3021-3025.

[18]Escobar J, Pereda J, Arduini A, et al. Cross-talk between oxidative stress and pro-inflammatory cytokines in acute pancreatitis: a key role for protein phosphatases[J]. Curr Pharm Des, 2009, 15(26): 3027-3042. DOI:10.2174/138161209789058075.

[19]Malmstrom ML, Hansen MB, Andersen AM, et al. Cytokines and organ failure in acute pancreatitis:inflammatory response in acute pancreatitis[J]. Pancreas, 2012, 41(2):271-277. DOI: 10.1097/MPA.0b013e3182240552.

[20]中國醫(yī)師協(xié)會胰腺病學專業(yè)委員會. 中國急性胰腺炎多學科(MDT)診治共識意見(草案)[J]. 中華胰腺病雜志, 2015，15(4)：217-224. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.04.001.

(本文編輯：屠振興)

Protective effect of heme oxygenase-1 overexpression on acute necrotizing pancreatitis rat model

ZhangFeihu,KongLi,DongXiaobin,HanNing,ZhaoHao,FanKailiang,MaoEnqiang,TangYaoqing,ZhangShengdao.

DepartmentofEmergencyCenter,AffiliatedHospital,ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250011,China

Correspondingauthor:KongLi,Email:kongli_sdszyy@sina.com

ObjectiveTo observe the effect of up-regulating Heme oxygenase-1(HO-1)expression in acute necrotizing pancreatitis(ANP) rats and to investigate its potential mechanism. MethodsA total of 63 male healthy Sprague-Dawley(SD) rats were treated by retrograde injection of 5% sodium taurocholate into pancreatic duct to establish ANP model. ANP rats were randomly divided into ANP group, Adenoviral empty vector(Adv-0) group and Adenoviral carriging HO-1 gene(Adv-Ho-1) group with 21 rats in each group. Adv-0 and Adv-HO-1 were constructed by Virus and Gene Therapy Center, Eastern Hapatobiliary Surhery Hospital.

In ANP group, 1ml normal saline solution per animal was intraperitoneally injected at 30 minutes after the establishment of model; in Adv-0 group, 2.0×109pfu/mL Adv-0 per animal was intraperitoneally injected; in Adv-HO-1 group, 2.0×109pfu/mL Adv-HO-1 per animal was intraperitoneally injected. 15 rats in each group were used to observe the survival rate for 72 hours and the other 6 rats in each group were executed at 20 hours after the establishment of ANP model to detect serum HO-1, IL-10 and TNF-α level. Pancreatic tissue was collected and the histopathological changes were observed. HO-1, IL-10 and TNF-α mRNA level in pancreatic tissue were detected by real-time PCR. ResultsAt 20 hours after ANP model establishment, serum HO-1 level in ANP group, Adv-0 group and Adv-HO-1 gene group was (0.90±0.09),(0.89±0.07) and(1.29±0.07)μg/L; serum IL-10 was (85.68±5.61),(81.11±2.48) and(120.93±8.07)ng/L; serum TNF-α was (47.77±6.54),(50.08±6.60) and (28.07±2.98)ng/L. HO-1 mRNA expression in pancreatic tissue in each group was 160.44±11.47, 158.23±10.51 and 237.25±12.09; IL-10 mRNA expression was 33.93±2.56, 34.13±3.01 and 60.02±2.89; TNF-αmRNA expression was 25.23±2.37, 25.03±2.07 and 13.12±1.77. The serum level and mRNA expression of HO-1 and IL-10 in Adv-HO-1 gene group were both significantly higher than those in ANP group and Adv-0 group, while TNF-αl level and mRNA expression were decreased, indicating that the differences were statistically significant(P<0.05). No statistically significant differences on serum level and mRNA expression of HO-1, IL-10 and TNF-αl were observed between Adv-0 group and ANP group(allP>0.05). At 72 hours after ANP model establishment, the survival rate in ANP group, Adv-0 group and Adv-HO-1 group was 6.67%, 0 and 46.67%. The survival rate of Adenoviral HO-1 gene group was significantly higher than that of ANP group and Adv-0 group, and the difference was statistically significant(P<0.05).No statistically significant difference on the survival rate was found between Adv-0 group and ANP group(P>0.05). ConclusionsAdenoviral transfection of HO-1 gene can up-regulate HO-1 expression, which could exert protective effects on ANP rats. The potential mechanism might be associated with up-regulating IL-10 and down-regulating TNF-α.

Pancreatitis, acute necrotizing;Heme oxygenase-1；Transfection；Tumor necrosis factor-alpho；Interleukin-10

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.04.010

250011濟南，山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院急診科(張飛虎、孔立、董曉斌、韓寧、趙浩、范開亮)；上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院重癥醫(yī)學科(毛恩強、湯耀卿、張圣道)

孔立，Email：kongli_sdszyy@sina.com

國家自然科學基金(81503543)；山東省自然科學基金(2015ZRB14327)

2015-12-31)