NMDA-NR2B亞基受體與神經(jīng)病理性疼痛的研究進展

李歡顏，陽巧云，彭良玉，曠 昕

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，湖南 衡陽 421000)

·綜 述·

NMDA-NR2B亞基受體與神經(jīng)病理性疼痛的研究進展

李歡顏，陽巧云，彭良玉，曠 昕

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，湖南 衡陽 421000)

NMDA受體是一種谷氨酸離子型受體，在興奮性突觸可塑性中起著重要作用?，F(xiàn)已證明NMDA-NR2B亞基受體參與學(xué)習(xí)記憶、慢性疼痛、局部缺血和神經(jīng)退行性疾病。NR2B亞基誘導(dǎo)長時程增強（LTP）的產(chǎn)生在中樞敏化及神經(jīng)病理性疼痛性的形成中起著重要的作用，NR2B受體拮抗劑可以有效的治療神經(jīng)病理性疼痛。本文就NMDA-NR2B亞基受體與神經(jīng)病理性疼痛的研究做一綜述。

NR2B亞基；NMDA受體；神經(jīng)病理性疼痛

神經(jīng)病理性疼痛是由于神經(jīng)系統(tǒng)損傷或者功能失調(diào)而引起的疼痛，可被分為外周神經(jīng)病理性疼痛和中樞神經(jīng)病理性疼痛。神經(jīng)病理性疼痛會導(dǎo)致長期痛苦和生活質(zhì)量下降，但是治療后只有少數(shù)患者痛苦得以減輕，對于患者和醫(yī)療工作者的治療都是一個巨大挑戰(zhàn)[1-2]。近年來隨著對疼痛的深入研究，中樞敏化被認為在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展和維持中起重要作用，而NMDA-NR2B亞基受體在疼痛傳遞和突觸可塑性上成為治療神經(jīng)病理性疼痛的重要靶點[3]。本文主要介紹NMDA-NR2B亞基受體結(jié)構(gòu)功能和在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生中的機制以及治療前景。

1 NMDA-NR2 B亞基受體的結(jié)構(gòu)功能

1.1 NMDA受體結(jié)構(gòu)分布 NMDA受體是一種谷氨酸離子型受體，在興奮性突觸可塑性中起著重要作用[4]。NMDA受體有3種成分結(jié)構(gòu)不同的亞基復(fù)合物：8個不同的NR1亞基由單個基因選擇性剪接產(chǎn)生；4個不同的NR2亞基(NR2A、NR2B、NR2C和NR2D)和2個NR3亞基(NR3A和NR3B)由6個獨立基因編碼。功能性NMDA受體包括異源NR1亞基加上一個或多個NR2A-D亞基，最常見的包括兩個NR1亞基與相同或不同的兩個NR2亞基。NR1亞基分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)任何位置；而NR2亞基局限性分布并且數(shù)量表達與發(fā)育相關(guān)，NR2A位于腦和脊髓，NR2B位于前腦和脊髓淺表板層[5-6]。

1.2 NR2B亞基結(jié)構(gòu)功能 NR2B亞基是一種膜蛋白，分子量為170～180 kD。它由四個不同調(diào)節(jié)單位組成：細胞外有兩大區(qū)域，氨基端結(jié)合域(NTD)和結(jié)合谷氨酸的S1-S2激動劑結(jié)合域(ABD)；跨膜區(qū)域包括三個跨膜片段和一個折返環(huán)路，形成離子通道并且類似一個倒置的K+通道；羧基端胞質(zhì)區(qū)是結(jié)合蛋白激酶的磷酸化位點，例如PKC和酪氨酸激酶等[7]。在早期發(fā)育階段，含有豐富的NR2B，但隨著年齡的增加而逐漸下降，并且受限于前腦，包括皮層、海馬、紋狀體、丘腦和嗅球[8]。NR2B亞基參與機體的生理功能，例如學(xué)習(xí)、記憶；同時參與病理生理疾病，如慢性疼痛、局部缺血和神經(jīng)退行性疾病[9]。含有NR2B亞基的NMDA受體具有如下特點：(1)對Ca2+有高度通透性；(2)對谷氨酸有較高的親和力[4]；(3)由其介導(dǎo)的興奮性突觸后電位(EPSPs)增加明顯；(4)與胞內(nèi)的鈣調(diào)蛋白激酶CaMKⅡ的親和力較高[10]。

2 NR2 B亞基在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生中的機制

中樞敏化為在刺激、炎癥和神經(jīng)損傷后疼痛通路中神經(jīng)元功能增加，突觸后膜興奮性和突觸效能增加，同時軀體感覺神經(jīng)元突觸可塑性增強[3]。NMDA受體激活在脊髓背角中觸發(fā)中樞敏化是必不可少的，特別是NR2B亞基[4]。而NR2B亞基調(diào)控神經(jīng)病理性疼痛的機制是由多重因素組成的，因此必須明確神經(jīng)病理性疼痛和NR2B亞基的調(diào)節(jié)機制。

2.1 NR2B亞基與LTP Qu等[11]結(jié)扎SD大鼠L5脊神經(jīng)背角神經(jīng)根遠端后，在鞘內(nèi)注射NR2B拮抗劑Ro25-6981后熱敏和機械敏下降；電生理學(xué)結(jié)果顯示W(wǎng)DR神經(jīng)元電活動被抑制。同時有研究證明脊髓背角GABA能神經(jīng)元去抑制后NR2B亞基表達增加[12]。因此，通過脊髓背角傷害性突觸傳遞誘發(fā)的LTP，進而導(dǎo)致中樞敏化和神經(jīng)病理性疼痛與激活脊髓NMDA-NR2B亞基受體有關(guān)。NMDA受體誘導(dǎo)LTP的主要機制是它的電壓依賴性。在靜息電位時NMDA受體處于非活動狀態(tài)，為了激活突觸上的NMDA受體，首先谷氨酸需要被釋放，并結(jié)合于NMDA-NR2B亞基受體；第二，突觸后膜需要去極化，使得細胞外的Mg2+移除。NMDA受體介導(dǎo)的Ca2+從細胞外進入突觸后細胞，然后釋放一系列突觸后信號分子[13]。NR2B亞基含有環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB），可耦合增加的Ca2+，當大量Ca2+從細胞外內(nèi)流時導(dǎo)致細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)磷酸化，從而激活CREB調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子[9]；同時內(nèi)流的Ca2+與調(diào)鈣蛋白（CaM）結(jié)合使CaM磷酸化，激活突觸后膜AMPAR，使更多的Ca2+內(nèi)流[4]。因此耦合和內(nèi)流增加的Ca2+形成正反饋加強NR2B功能進一步誘導(dǎo)LTP。

2.2 NR2B亞基與突觸后密度(PSD)PSD95是膜-相關(guān)鳥苷酸激酶(MAGUKs)家族中的一員，包括N末端三個PDZ區(qū)域，中間區(qū)域一個Scr同源區(qū)3(SH3)和C末端一個鳥苷酸激酶樣(GK)區(qū)域。其中第二個PDZ區(qū)域在C端含有一個PDZ結(jié)合基序(tSXV)，可以結(jié)合NMDA-NR2B亞基，從而介導(dǎo)NMDA受體功能；PSD-95還能結(jié)合多種信號分子從而激活下游信號級聯(lián)。PSD-95同時含有網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，可以錨定和集合突觸后谷氨酸受體并將Fyn激酶帶到底物NR2B附近，在突觸可塑性和神經(jīng)發(fā)展中有重要作用[14-17]。Ba等[16]在左旋多巴引起的運動障礙(LID)大鼠紋狀體內(nèi)注射PSD-95mRNA反義寡核苷酸(PSD-95 ASO)，免疫印跡和免疫沉淀的結(jié)果顯示NR2B酪氨酸磷酸化減少并且減弱NR2B與Fyn反應(yīng)；此結(jié)果說明抑制PSD-95下調(diào)NMDAR激活同時對LID有治療作用。有實驗證明，向鞘內(nèi)注射模擬肽Myr-NR2B9c干擾PSD-95和NR2B反應(yīng)，從而減輕骨性癌痛[18]。無論NR2B還是PSD-95都分布在脊髓灰質(zhì)，分布最密集的地方在表面板層，因此他們是接收終端傷害感受器的理想位置[19]。PSD-93也是膜-相關(guān)鳥苷酸激酶(MAGUKs)家族中主要成員,含有PDZ、SH3、GK三個區(qū)域。PSD-93通過PDZ區(qū)域在突觸后密度特異性結(jié)合NMDA受體C端，是耦聯(lián)NMDA激活的特定細胞內(nèi)重要信號分子[20]。近來，Zhang等[21]觀察PSD-93敲除(KO)小鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)后，TTC染色結(jié)果顯示梗死面積明顯減少；Western blot結(jié)果顯示Tyr1472-NR2B磷酸化減少并且影響NR2B和Fyn相互作用。也就是說PSD93缺失抑制Fyn介導(dǎo)的NR2B磷酸化并且保護局部腦缺血。同時在SD大鼠體內(nèi)研究中，干擾PSD-93已被證明在減輕外周損傷引起的神經(jīng)病理性疼痛和CFA引起的炎性疼痛[22]。

2.3 NR2B亞基磷酸化 NR2B亞基羧基端主要作用是翻譯后酶的修飾，如磷酸化[7]。磷酸化調(diào)控許多細胞過程，包括蛋白活性、定位、流動性和蛋白相互作用[9]。Xu等[23]證明在持續(xù)炎癥性反應(yīng)(CFA)后磷酸化NR2B在總NR2B的比例明顯增加。Luo等[24]發(fā)現(xiàn)腸易激綜合征(IBS)大鼠脊髓背角NR2B亞基表達量增加，在鞘內(nèi)注射酪氨酸激酶抑制劑后顯著下降。因此，NR2B亞基激活是由酪氨酸磷酸化調(diào)控，同時在神經(jīng)病理性疼痛中由酪氨酸引起NR2B亞基磷酸化是中樞敏化的重要機制?，F(xiàn)有許多絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點已在NMDA受體亞單位被確定，例如：PKA、PK、CaMKII，這些激酶可以調(diào)控NMDA受體細胞內(nèi)運輸或者離子通道特性，造成突觸強度變化引起多種形式突觸可塑性[25]。NR2B亞基的具有7個位于突觸后密度(PSD)的酪氨酸磷酸化位點，Tyr1472是主要的磷酸化位點。Y1472含有酪氨酸基礎(chǔ)內(nèi)在基序(YEKL)，直接與AP-2適配器中鏈結(jié)合。NR2B亞基Y1472磷酸化后中斷其結(jié)合，由此抑制NR2B介導(dǎo)的內(nèi)吞作用[9，26]。Abe等[27]在L5脊神經(jīng)斷離小鼠脊髓免疫熒光結(jié)果中發(fā)現(xiàn)在Ⅰ、Ⅱ板層pY1472-NR2B明顯增加，而口服NR2B拮抗劑CP-101，606后接近于正常水平；并且在Fyn基因敲除小鼠術(shù)后，免疫熒光顯微鏡下幾乎無pY1472-NR2B。因此，F(xiàn)yn激酶激活NR2B亞基Tyr1472磷酸化對維持神經(jīng)病理性疼痛是必不可少的。最近的研究表明，酪氨酸磷酸化的NR2B亞基由STEP(富含酪氨酸酶紋狀體)控制，STEP對亞基在Y1472上有去磷酸化作用，增加NMDA受體內(nèi)吞[28]。

2.4 NR2B亞基棕櫚?；?除了磷酸化，另一種蛋白修飾類型是調(diào)控蛋白定位和功能，稱為修飾后棕櫚?；?。由半胱氨酸殘基的硫酯鍵共價結(jié)合棕櫚酰蛋白，與磷酸化相似的，這種修飾是不穩(wěn)定和可逆的。棕櫚酸是一個含有飽和脂肪酸的16碳，是大腦中最豐富的脂肪酸[29-30]。NR2A和NR2B棕櫚酰在皮質(zhì)神經(jīng)有兩種不同的半胱氨酸群：棕櫚?；^(qū)域的第一簇(Cys ClusterⅠ)，控制表面NMDA受體穩(wěn)定表達和其內(nèi)在結(jié)構(gòu)并且在細胞表面穩(wěn)定調(diào)控NR2A/ B酪氨酸磷酸化；第二簇(Cys ClusterⅡ)在C末端中間區(qū)，由棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶GODZ棕櫚?；プ貦磅；怯捎谑荏w在高爾基體聚集并減少表面NMDA受體表達[31]。Xia等[32]證明在慢性背角神經(jīng)根壓迫模型(CCD)過程中NR2B棕櫚?；斤@著增加并且其上調(diào)與NR2B-Tyr1472磷酸化同步；術(shù)后14 d在大鼠鞘內(nèi)注射2-BP后，一種棕櫚?；种苿篘R2B棕櫚酰化和磷酸化下調(diào)。因此棕櫚酰化是引起神經(jīng)病理性疼痛的重要組成部分，可能會成為治療慢性疼痛的潛在靶點。

2.5 NR2B亞基泛素化 泛素化作為又一個翻譯后修飾，可以改變突觸蛋白的構(gòu)成和功能，人們對它的認識也日漸增加。泛素是一種含有76個氨基酸的蛋白，在ATP依賴性酶反應(yīng)中共價連接底物，并分為泛素激酶E1、泛素結(jié)合E2和泛素連接酶E3。泛素化要求同時作用E1、E2、E3，它緊密調(diào)控所有細胞，有精確的時間和空間性，并且E3是通過酶識別產(chǎn)生特異性反映的關(guān)鍵組成部分[33]。E3與NR2B亞基反應(yīng)作為一個可能的機制，對NMDAR同時進行磷酸化和泛素化調(diào)控。有報道，Mib-2作為一種新型E3連接酶，它泛素化NMDA-NR2B受體，從而增加Tyr磷酸化依賴行為[34]。

2.6 突觸前NR2B亞基 谷氨酸是主要的快速興奮性遞質(zhì)在中樞系統(tǒng)中，主要作用于突觸后受體介導(dǎo)興奮神經(jīng)傳遞[35]。現(xiàn)已證明釋放的谷氨酸與突觸后膜NMDA-NR2B亞基受體結(jié)合引起突觸后膜去極化從而導(dǎo)致LTP[11]，卻很少研究突觸前NR2B對神經(jīng)病理性疼痛的影響。最近有研究表明成年大鼠在外周神經(jīng)損傷情況下，從脊髓初級傳入中樞的釋放的谷氨酸調(diào)節(jié)突觸前NMDA受體，而突觸前NMDA受體主要由NR2B組成；同時Western blot結(jié)果證明在大鼠脊髓損傷同側(cè)背角神經(jīng)根NR2B受體蛋白表達增多[1]。Wind-up是C-纖維初級傳入神經(jīng)受電刺激誘發(fā)，脊髓神經(jīng)元興奮性隨其頻率增加，從而增加脊髓神經(jīng)元和疼痛的電活動[36]。谷氨酸激活突觸前NMDA受體就是一種Wind-up現(xiàn)象，所以抑制突觸前NR2B亞基激活可以有效的減少谷氨酸釋放，從而減輕疼痛。

3 NR2B亞基的治療前景

NMDA受體阻滯劑MK-801在很大程度上抑制脊髓背角的中樞敏化現(xiàn)象，但是具有嚴重的副作用，例如：學(xué)習(xí)和記憶障礙、感覺或運動障礙、機能亢進等[2，37]。近來有報道，在SNL大鼠中鞘內(nèi)注射NR2B亞基的選擇性抑制劑RO25-6981，鎮(zhèn)痛和抗痛覺過敏作用具有劑量依賴性而不引起運動功能障礙；另一種NMDA-2B受體拮抗劑ifenprodil顯著抑制機械異常性疼痛，但不是熱痛覺過敏[11]。NR2B亞基的選擇性抑制劑在治療神經(jīng)性病理疼痛中，對于NMDA受體拮抗劑有更強的止痛效果，并且降低了其嚴重的副作用，有其下原因：第一，Ro 25-6981對NR1/NR2B比NR1/NR2A受體更具選擇性，是其的5 000倍[38]，而NR2B參與神經(jīng)中樞機體的疼痛行為；第二，由于NR2B在脊髓淺層分布比較局限[8]，所以產(chǎn)生的副作用更小。

NR2B選擇性拮抗劑在動物實驗中有很大的進展，但是還未成為批準的藥物，因為它具有hERG K+通道介導(dǎo)的心臟毒性并且口腔生物利用度低[39]。Tan等[40]鞘內(nèi)注射針對NR2B亞基的siRNA后，減少了由外周炎癥引起的疼痛反應(yīng)。但是NR2B-siRNA沉默基因時間短，而shRNA構(gòu)建短發(fā)卡RNA干擾真核表達載體，對脊髓NR2B有長期而穩(wěn)定的基因沉默。近來，Zhang等[41]在腳底注入1%福爾馬林的小鼠中鞘內(nèi)注射NR2B-shRNA，引起NR2B亞基沉默并且減少了傷害性疼痛。

4 結(jié)語

綜上所述，NMDA-NR2B亞基受體在疼痛傳遞和突觸可塑性上有重要作用。但是還有很多機制尚未了解，NR2B亞基除了酪氨酸磷酸化位點與神經(jīng)病理性疼痛相關(guān)外，還含有絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點；棕櫚?；?、泛素化和谷氨酸調(diào)節(jié)突觸前NMDA受體的具體機制尚不明確，是否能作為治療神經(jīng)病理性疼痛的新靶點?雖然，隨著人們對神經(jīng)性病理疼痛的深入了解，NR2B亞基拮抗劑比NMDA受體拮抗劑具有更強的止痛效果并產(chǎn)生更少的副作用，但是針對NR2B亞基下游蛋白，鞘內(nèi)注射NR2B沉默基因或者反義寡核苷酸來治療神經(jīng)病理性疼痛，可能完全會避免產(chǎn)生副作用而成為新的研究靶點。

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A

1003—6350（2015）23—3503—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.23.1268

2015-05-09)

國家自然科學(xué)基金(編號：81300971)

曠 昕。E-mail：kx6924@126.com