鐵皮石斛授粉結實特性試驗

何玉友，戚利潮，李海龍，邊軍英，高愛新

(1．中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江富陽311400;

2．浙江省杭州市富陽區(qū)農(nóng)業(yè)局，浙江富陽311400;3．浙江亞林生物科技股份有限公司，浙江富陽311400)

鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，具有益胃生津、滋陰清熱等獨特功效［1］，是我國傳統(tǒng)名貴珍稀中藥材。鐵皮石斛種子極其細小，無胚乳，自然條件下需要和某些真菌共生才能萌發(fā)［2］，自然繁殖率極低，生長緩慢且生境要求獨特，加上人為過度采集和自然生境破壞，目前我國野生鐵皮石斛資源頻臨滅絕，已被列為國家二級保護植物［3］。隨著植物組培技術的推廣應用和設施栽培方法的不斷改進，鐵皮石斛現(xiàn)已實現(xiàn)人工規(guī)模化擴繁［4］，以不斷滿足日益增長的生產(chǎn)和消費需求。人工授粉是獲取鐵皮石斛繁殖材料和進行種質創(chuàng)制的主要途徑，筆者在大棚設施栽培和附樹仿生栽培條件下開展雜交、自交授粉試驗和昆蟲輔助授粉調查，以冷藏花粉授粉測定花粉活力，開展花粉粘著劑授粉對比試驗，研究鐵皮石斛授粉結實特性，以期為制定育種策略和生產(chǎn)實踐提供理論依據(jù)和適用技術。

1 材料與方法

1．1 試驗區(qū)概況 試驗基地位于杭州市富陽區(qū)富春街道來龍山西麓城市森林公園入口處，地處 119°58′E、30°15′N，屬亞熱帶季風氣候，四季分明、雨量充沛、溫和濕潤，年均氣溫16．3℃，年均降水量1 479 mm，年日照時數(shù)1 759 h，無霜期約238 d，為鐵皮石斛自然產(chǎn)地之一［5］。

1．2 試驗材料 供試材料為種植年限在3年生以上的鐵皮石斛大棚盆栽苗或附樹仿生栽培苗，均起源于浙江野生種源實生組培苗，由浙江亞林生物科技股份有限公司提供。

1．3 試驗設計

1．3．1 授粉方式。

1．3．1．1 同花授粉。在同一朵花內開展授粉。分別盆栽和附樹2種不同栽培方式，每種栽培方式均重復2次。盆栽，每重復選取10盆，每盆授粉2個以上莖干、10朵花以上。梨樹附生，每重復選取5叢，每叢授粉2個以上莖干、20朵花以上。

1．3．1．2 同序授粉。在同一花序內不同花朵間交叉授粉。每重復選取盆栽5盆，每盆授粉花序4個以上、花數(shù)不少于10朵、莖干多于2支。重復2次。

1．3．1．3 同枝授粉。在同一莖干上不同花序間相互授粉。每重復選取盆栽1盆，每盆選取5個以上莖干，授粉50朵花以上。重復2次。

1．3．1．4 同叢授粉。同一枝叢不同莖干間相互授粉。選取盆栽5盆，每盆選1叢，對其中3個以上莖干開展授粉，授粉花數(shù)多于20朵。

1．3．1．5 異花授粉?；ǚ蹓K來自不同株叢。分別盆栽和附樹2種方式，各重復2次，每重復5盆或5叢。盆栽，每盆授粉2個以上莖干、花數(shù)大于10朵。梨樹附生，每叢授粉莖干2個以上、花數(shù)超過20朵。

1．3．1．6 自然授粉。分別不同栽培條件，在溫室大棚內和野外不同附主(梨樹Pyrusserotina Rehd、杜英Elaeocarpussylvestris(Lour．)Poir．)上，隨機各選5 盆或5 叢，分別統(tǒng)計每盆或每叢的開花枝數(shù)和花朵量。

1．3．2 花序冷藏。采集剛開放2～3 d的新鮮花序放入塑料袋中，輕縛袋口置于4℃冰箱中冷藏。貯藏期間每天取花序進行授粉試驗，同時選擇相同開放程度的5盆植株作對照，每天從對照上采集花序進行授粉對比試驗。

1．3．3 粘附助劑。任選植株1盆，每莖干僅保留中上部相鄰2個花序，整盆授粉。上端花序均用75%酒精作為牙簽粘取花粉塊的浸潤助劑，下面花序用清水作助劑，進行異花授粉對比試驗;相應變換助劑種類與花序位置，同法對另1盆開展試驗。重復2次。

1．4 授粉操作 2015年5～6月在鐵皮石斛栽培基地內，選擇莖干粗壯、生長繁盛、無病蟲害的植株進行人工授粉。先用鑷子掰掉父本花朵的唇瓣，小心掀開藥帽，用牙簽浸潤助劑后將花粉粒粘起，送往已去掉唇瓣的母本花朵的柱頭窩內。授粉過程中要小心操作，不能損傷柱頭窩，花粉塊粘附在母本的柱頭窩內授粉才完成;經(jīng)常更換牙簽，保持傳粉器具的潔凈，避免雜物污染和花粉干擾。

1．5 調查統(tǒng)計 授粉后及時掛牌做標記。授粉30 d后調查每處理的結實數(shù)量，計算座果率，運用Excel 2003進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

2 結果與分析

2．1 授粉方式與座果率 鐵皮石斛為總狀花序，屬節(jié)生或頂生花序類型。花序一般多著生于多年生枝條的中上部，位置與葉腋相對，每序通常具花3～5朵。經(jīng)長期進化，鐵皮石斛花器與傳粉形成系列獨特的適應機制。如花朵授粉成功，第2天花萼、花瓣明顯收縮直至縱向收攏閉合，3 d后花朵基部開始加粗，5 d后花冠干縮萎蔫，花梗頂端顏色變深、增粗現(xiàn)象更加明顯，10 d后幼果初具雛形;如花朵授粉失敗，第2天花冠也明顯收縮，3 d后花梗顏色開始變黃，5 d左右即行脫落。撕揭、損傷唇瓣或藥帽而未經(jīng)授粉的花朵，則花期如常，無上述明顯變化。

表1顯示，授粉方式對鐵皮石斛座果率影響很大，其中以異花授粉的座果率最高，平均達90．51%，而其他自花授粉方式(同花、同序、同枝)均比較低，一般不超過40%，平均為5．55%，可見鐵皮石斛以異花授粉為主;自花授粉座果率因個體而異，變幅較大(0～36．84%)，說明部分植株可自花結實;同叢授粉座果率變幅較大，主要源于叢內個體親疏構成不同，無親緣關系的叢生植株間相互授粉座果率高，但因叢內多屬萌孽，故平均座果率僅17．22%;調查表明，野外條件下鐵皮石斛依靠昆蟲輔助授粉能受精結實，但結實率通常較低，一般低于4%，平均為1．82%，其中以郁閉林分內杜英樹上附生的植株為高，結實率達2．84%。從鐵皮石斛在不同栽培條件下各種授粉方式平均座果率的綜合比較(圖1)可看出，異花授粉座果率顯著高于其他授粉方式。異花授粉應是鐵皮石斛的主要繁殖方式，也是生產(chǎn)繁育的主要手段。

表1 不同授粉方式對鐵皮石斛座果率的影響

2．2 花序貯藏與座果率 4℃冷藏鐵皮石斛花序，每天授粉連續(xù)9 d，以受精結實情況反映冷藏花粉的活力變化，并以相同花期的自然花序作對照。結果表明(表2)，試驗期內不同貯藏時間的冷藏花粉仍具有較高活性，座果率均保持在89%以上，平均座果率達94．22%，座果率日變化比較平穩(wěn)，花粉活性隨冷藏時間無明顯變化趨勢，可見短期冷藏花序不會影響授粉效果。經(jīng)t檢驗，冷藏花序與自然花序(對照)的座果率間無顯著差異(t=-0．534 9 ＜ t0．05=2．160 4)，說明鐵皮石斛花序離體冷藏與活體留枝保存均能較長時間保持花粉活力，花粉可授性時間較長。

表2 不同貯藏時間的鐵皮石斛冷藏花序授粉效果

2．3 粘附助劑與座果率 鐵皮石斛人工輔助授粉時，通過助劑潤濕傳粉器具后，能使傳粉器具輕易粘附花粉塊進行授粉操作，牙簽相較鑷子等器具更為方便、靈活，可大大提高工作效率。表3顯示，使用75%酒精或清水作授粉時的粘附助劑，平均座果率高達91．29%，經(jīng)雙因素方差分析，助劑種類(F=0．404 2)和花序節(jié)位(F=0．439 2)間均不存在顯著差異(F0．05=7．708 6)。作為普通溶劑，酒精與清水非常容易制取，作為粘附助劑均能保證授粉效果，可在生產(chǎn)實踐中任選使用。

表3 不同粘附助劑的授粉效果

3 結論與討論

(1)據(jù)報道，多數(shù)蘭科植物自交親和，但石斛屬大部分種類自交不親和［6］。該研究表明鐵皮石斛異花授粉平均座果率高達90．51%，而自花授粉平均為5．55%，可見鐵皮石斛屬部分自交親和，而異花授粉是其主要繁殖方式。自交結實情況因個體而異差別較大，變幅為0～36．84%，經(jīng)測算能自交結實的株叢約占3成;野外條件下鐵皮石斛存在自然結實現(xiàn)象，但結實率通常低于4%。鐵皮石斛這種異花授粉為主且部分自交親和、能自然結實的授粉結實特性，對于島狀零星分布的瀕危資源保護、種群繁衍及制定育種策略具有重要的理論價值和現(xiàn)實意義。

(2)鐵皮石斛花粉活力持續(xù)時間較長，幾乎整個花期人工授粉結實率均可達85%以上，有效保存花粉對解決花期不遇或開展異地雜交具有重要意義。鐵皮石斛花序4℃離體冷藏，冷藏后9 d內，其花粉授粉的座果率均在89%以上，平均為94．22%，花粉活力遠高于相同貯藏時限、不同條件下的干燥花粉［7］，花序冷藏不失為一種簡便實用的短期保存花粉的有效方法。成熟度較高花蕾中花粉也具授粉活性，其淡白色的花粉塊也能使雌蕊受精結實，初步試驗結實率＞80%，但花蕾冷藏后停止發(fā)育，花瓣不再開放，不利授粉操作，故冷藏花序以采集剛開放的新鮮花序為宜。

(3)蘭科植物花粉外面包裹類脂膜，使得蘭花花粉粒黏連成花粉塊［8］。但這層類脂膜粘性不強又不保濕，花粉塊暴露空氣中很容易失水干縮失去粘性。如用酒精或清水作粘附助劑，潤濕授粉器具后很容易從藥帽中粘附花粉，且不影響花粉活性，平均座果率可達90%以上。實踐操作中任選一種作助劑，能使授粉操作更為便捷，可大大提高授粉效率。花粉塊在空氣中暴露時間不宜過長，授粉時最好從花朵藥帽中直接粘取，隨取隨授。

(4)鐵皮石斛花量大、可授期長，通過人工授粉容易制取大量果實。鐵皮石斛幼果在生長發(fā)育過程中，存在落果、敗育和昆蟲為害、取食現(xiàn)象。不同授粉方式對鐵皮石斛種子活力的影響程度、落果原因等尚不明確，需要進一步研究。

［1］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典:一部［S］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:265．

［2］陳曉梅，李媛媛，郭順星．石斛屬植物種子萌發(fā)的研究進展［J］．中國藥學雜志，2013，48(19):1629 －1633．

［3］國家環(huán)境保護局，中國科學院植物研究所．中國珍稀瀕危保護植物名錄［M］．北京:科學出版社，1987．

［4］斯金平，諸燕，朱玉球．鐵皮石斛人工栽培技術研究與應用進展［J］．浙江林業(yè)科技，2009，29(6):66 －70．

［5］倪勤武，來平凡．浙江富陽發(fā)現(xiàn)野生鐵皮石斛新分布［J］．林業(yè)科學研究，2000，13(2):222．

［6］王曉靜，余樂，殷壽華．授粉方式對流蘇石斛結實率及種子活力的影響［J］．云南大學學報(自然科學版)，2009，31(S1):374－377．

［7］朱波，苑鶴，俞巧仙，等．鐵皮石斛花粉活力與種質創(chuàng)制研究［J］．中國中藥雜志，2011，36(6):755 －757．

［8］鄭寶強，王雁，彭鎮(zhèn)華，等．卡特蘭花粉萌發(fā)和花粉貯藏性研究［C］//張啟翔．中國觀賞園藝研究進展．北京:中國林業(yè)出版社，2013:188－192．