高溫木質(zhì)素分解菌的分離、篩選及鑒定

張 亮，林 寧，闞 立

(1．南京師范大學(xué)泰州學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇泰州225300;2．泰州機(jī)電高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇泰州225300)

木質(zhì)素是由苯丙烷結(jié)構(gòu)單元通過(guò)醚鍵和碳碳鍵連接而成的聚酚類三維網(wǎng)狀高分子芳香族化合物，是構(gòu)成植物細(xì)胞的主要物質(zhì)，約占植物體干重的20%。它是非常豐富的碳素資源［1］。據(jù)估測(cè)，全球每年可產(chǎn)生約6×1014t木質(zhì)素，主要存在于農(nóng)作物廢棄秸桿和工業(yè)造紙材料中。木質(zhì)素分子空間三維結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，在自然界中很難被微生物分解利用［2］。因此，高效降解木質(zhì)素，使其資源化，日益引起人們的重視。

目前，木質(zhì)素的微生物分解是由真菌、細(xì)菌等各種微生物群落共同作用的結(jié)果［3］。其中，木質(zhì)素的微生物分解研究主要集中在以白腐真菌為代表的真菌上。白腐真菌能夠分泌胞外氧化酶降解木質(zhì)素，包括木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(Lignin peroxidase，LiP)、錳過(guò)氧化物酶(Manganesedependent peroxidase，MnP)和漆酶(Laccase)，因此，它被認(rèn)為是最主要的木質(zhì)素降解微生物。雖然白腐真菌具有較好的分解效果，但是它生長(zhǎng)緩慢、產(chǎn)酶量低的特點(diǎn)使其難以推廣到工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。因此，有必要尋找新途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素的快速分解。在木質(zhì)素的降解過(guò)程中，細(xì)菌發(fā)揮一些關(guān)鍵性作用，如支鏈的改性、環(huán)開(kāi)裂和解聚等，并且由于細(xì)菌的生長(zhǎng)周期短，易培養(yǎng)，適合大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。因此，細(xì)菌在木質(zhì)素分解中的作用不容忽視［4］。

在細(xì)菌分解木質(zhì)素的研究中，對(duì)木質(zhì)素有降解能力較強(qiáng)的細(xì)菌主要包括鏈霉菌(Streptomyces)、節(jié)桿菌(Arthrobacter)、小單孢菌(Micromonospora)等放線菌，還有假單胞菌(Pseudomonas)、黃桿菌(Flavobacterium)等非絲狀細(xì)菌［5］。這些細(xì)菌能夠分解不同聚合形態(tài)的木質(zhì)素，在木質(zhì)素降解的不同階段發(fā)揮作用。但是，白腐菌、黃孢原毛平革菌、部分細(xì)菌等屬于低溫木質(zhì)素降解菌。雖然降解木質(zhì)素能力強(qiáng)，但農(nóng)作物秸稈發(fā)酵溫度較高。這些菌在高溫條件下不易存活，在此特殊環(huán)境中對(duì)木質(zhì)素的降解率非常低，因此篩選高溫、產(chǎn)酶活性強(qiáng)、發(fā)酵周期短的木質(zhì)素分解菌具有重要意義。以新鮮馬糞為供試材料，筆者篩選出高溫木質(zhì)素分解菌，并且對(duì)其產(chǎn)酶活性進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)16SrDNA測(cè)序?qū)δ康木赀M(jìn)行鑒定，以期為木質(zhì)素分解菌的選育和菌劑的制備提供菌種資源。

1 材料與方法

1．1 菌種來(lái)源 對(duì)采自泰州市動(dòng)物園新鮮的馬糞進(jìn)行分離、獲取。

1．2 培養(yǎng)基 菌種篩選培養(yǎng)基(BM培養(yǎng)基)組成為:酵母浸出液 10 g，葡萄糖 20 g，木質(zhì)素 2．5 g，瓊脂 15 g，水 1 000 ml，pH 7．0。產(chǎn)酶培養(yǎng)基(LB液體培養(yǎng)基)組成為:酵母膏5 g，胰蛋白胨 10 g，氯化鈉10 g，水 1 000 ml，pH 7．0。

1．3 菌種的分離與篩選

1．3．1 初篩。將采集到的樣品在LB培養(yǎng)基中富集后，采用平板梯度稀釋法，吸取0．2 ml菌懸液均勻涂布在BM培養(yǎng)基上，在55℃條件下培養(yǎng)2～3 d，觀察透明圈的大小，并且記錄其直徑。

1．3．2 復(fù)篩。挑取產(chǎn)生透明圈直徑較大菌株的一個(gè)單菌落，接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜后，離心，上清液即為粗酶液，在BM培養(yǎng)基中打若干小孔，每個(gè)孔加入100μl粗酶液，55℃培養(yǎng)4 h，然后用濃度1%三氯化鐵和鐵氰化鉀按照1∶1配制(現(xiàn)配現(xiàn)用)，染色約30 min，用濃度0．9%生理鹽水脫色，觀察透明圈的大小，并且記錄。篩選出4株透明圈直徑較大的菌株，保存于LB固體培養(yǎng)基中，備用。

1．4 粗酶液的制備及活性測(cè)定 從LB固體培養(yǎng)基挑取菌種，接種于50 ml的LB培養(yǎng)基中，55℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜。從種子培養(yǎng)基中吸取5μl，轉(zhuǎn)接于5 ml種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD到0．6左右。12 000 r/min，離心5 min，上清液即為粗酶液，4℃保藏，備用，測(cè)定相關(guān)酶活［6］。

(1)漆酶的測(cè)定。向20 ml的反應(yīng)體系中加入18．6 ml的50 mmoL/L的乙酸－乙酸鈉緩沖液(pH 4．5)，將其在25℃預(yù)熱10 min后，加入0．4 ml的10 mmol/L的愈創(chuàng)木酚和1 ml的粗酶液，在反應(yīng)溫度為25℃時(shí)測(cè)定465 nm處吸光度的增加。每分鐘內(nèi)氧化1．0μmol愈創(chuàng)木酚所需酶量為一個(gè)酶活力單位。

(2)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的測(cè)定。向3 ml反應(yīng)體系中加入1．5 ml 125 mmol/L 酒石酸(pH 3．0)、10 mmoL/L 藜蘆醇1．0 ml、10 mmol/L 過(guò)氧化氫0．1 ml、粗酶液0．4 ml，加入過(guò)氧化氫后啟動(dòng)反應(yīng)，在310 nm處測(cè)定吸光度的增加。每分鐘內(nèi)氧化1．0μmol藜蘆醇所需酶量為一個(gè)酶活力單位。

(3)錳過(guò)氧化物酶的測(cè)定。反應(yīng)體系中含有50 mmol/L乳酸鈉緩沖液(pH 4．5)3．4 ml、1．6 mmol/L 硫酸錳溶液 0．1 ml、粗酶液0．4 ml，預(yù)熱至 37 ℃ 后加入 1．6 mmol/L 雙氧水0．1 ml啟動(dòng)反應(yīng)，在室溫條件下測(cè)定240 nm處紫外光反應(yīng)3 min時(shí)OD的改變。每分鐘內(nèi)氧化1．0μmol的Mn2+轉(zhuǎn)化成Mn3+所需酶量為一個(gè)酶活力單位。

1．5 目的菌株的鑒定 采用CTAB法提取細(xì)菌總DNA［7］;分別利用細(xì)菌16SrDNA通用引物F27/R1492進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(20μl):DNA模板3μl;PCR樣液10μl;27F(20 μmol/L)0．8 μl;1495F(20 μmol/L)0．8 μl;ddH2O5.4 μl。PCR條件為:95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，52℃退火30 s，72 ℃ 延伸 1．5 min，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后，送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2．1 菌株的初篩 利用BM培養(yǎng)基初篩和復(fù)篩后，從馬糞中分離出產(chǎn)生透明圈較大的4株細(xì)菌。透明圈直徑見(jiàn)表1，其中X-2的透明圈直徑最大，其透明圈直徑與菌落直徑比值也最大。

表1 所篩菌株的透明圈直徑

2．2 菌株的復(fù)篩 對(duì)4株菌株漆酶、過(guò)氧化物酶和錳過(guò)氧化物酶3種酶活進(jìn)行測(cè)定。由表2可知，菌株M-2產(chǎn)漆酶和錳過(guò)氧化物酶活性最強(qiáng)，M-4菌株產(chǎn)過(guò)氧化物酶活性最強(qiáng)。因此，選擇M-2菌株進(jìn)行后續(xù)種屬鑒定。

2．3 目的菌株的鑒定 通過(guò)對(duì)M-2菌株的16SrDNA序列進(jìn)行比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)該菌株的16SrDNA序列與假單胞菌屬的綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)同源性最高，序列相似性為85%(圖1)。因此，最終確定M-2菌株為假單胞菌屬的綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)。

表2 高溫木質(zhì)素分解菌的產(chǎn)酶活性 U/ml

3 討論

通過(guò)初篩和復(fù)篩，從馬糞中獲得4株具有分解木質(zhì)素的菌株，其中M-2的產(chǎn)酶活性較強(qiáng)。經(jīng)16SrDNA遺傳學(xué)鑒定，確定M-2為假單胞菌屬的綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)。菌株M-2在高溫條件下具有生長(zhǎng)速度快和產(chǎn)酶活性強(qiáng)的能力。有研究表明，在沒(méi)有外界添加任何外源碳氮源，將分離獲得的芽孢桿菌接種到秸稈木質(zhì)素中進(jìn)行堆積發(fā)酵，表現(xiàn)出較強(qiáng)的降解作用。通過(guò)玉米秸稈16 d的發(fā)酵，木質(zhì)素降解率可達(dá)24%［8］。

我國(guó)每年產(chǎn)生大量的農(nóng)作物秸稈。這些秸稈資源僅有很少部分作為動(dòng)物飼料、人造板原料和食用菌栽培基質(zhì)原料［9－10］，其余大部分資源被農(nóng)民就地焚燒、四處堆放。這不僅造成生物資源的極大浪費(fèi)，而且嚴(yán)重破壞生態(tài)環(huán)境［11］。秸稈中含有大量的木質(zhì)素和纖維素，在常溫下難以降解。因此，后續(xù)可以將分離獲得的高溫木質(zhì)素分解中用于農(nóng)作物秸稈的堆積發(fā)酵，從而快速、高效、無(wú)污染地處理農(nóng)作物秸稈。

［1］李成翠，李術(shù)娜，朱寶成．高活性木質(zhì)素降解菌株T-8的分離、篩選與鑒定［J］．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33(6):57 －62．

［2］曲音波．木質(zhì)纖維素降解酶系的基礎(chǔ)和技術(shù)研究進(jìn)展［J］．山東大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版)，2011，46(10):160 －169．

［3］冀珍芳，石淑蘭．木質(zhì)素的微生物降解［J］．廣西輕工業(yè)，2002，15(1):4－5．

［4］曲音波．木質(zhì)纖維素降解酶與生物煉制［M］．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2011．

［5］主巍，李秋菊，張英，等．木質(zhì)素酶及其高產(chǎn)菌株選育的研究進(jìn)展［J］．畜牧與飼料科學(xué)，2011，32(1):58 －60．

［6］TUOMELA M，VIKMAN M，HATAKKA A，et al．Biodegradation of lignin in a compost environment:A review［J］．Bioresource technology，2000，72(2):169 －183．

［7］TUOMELA M，OIVANENL P，HATAKKA A．Degradation of synthetic 14C-lignin by various white-rot fungi in soil［J］．Soil biology ＆ biochemistry，2002，34(11):1613 －1620．

［8］任克中，張福元．木質(zhì)素酶及其生產(chǎn)菌株選育的研究進(jìn)展［J］．飼料與畜牧，2010(6):36 －39．

［9］蔣應(yīng)梯，莊曉偉，王衍彬．利用農(nóng)作物秸稈開(kāi)發(fā)生物能源和有機(jī)肥初探［J］．生物質(zhì)化學(xué)工程，2006，40(6):48 －50．

［10］袁玲，張宣，楊靜，等．不同栽培方式和秸稈還田對(duì)水稻產(chǎn)量和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響［J］．作物學(xué)報(bào)，2013，39(2):350 －359．

［11］席北斗，劉鴻亮，孟偉，等．垃圾堆肥高效復(fù)合微生物菌劑的制備［J］．環(huán)境科學(xué)研究，2003，16(2):58 －64．