VEGF－C與VEGFR－3在喉癌組織中的表達(dá)及其與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系

夏 冰， 趙 軍， 王乃會(huì)， 馮 劍， 董偉達(dá)

(1.南通大學(xué)附屬建湖醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科， 江蘇 建湖 224700 2.江 蘇 省 人 民 醫(yī) 院， 江蘇 南京 210029)

VEGF－C與VEGFR－3在喉癌組織中的表達(dá)及其與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系

夏 冰1， 趙 軍1， 王乃會(huì)1， 馮 劍1， 董偉達(dá)2

(1.南通大學(xué)附屬建湖醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科， 江蘇 建湖 224700 2.江 蘇 省 人 民 醫(yī) 院， 江蘇 南京 210029)

目的:探討血管內(nèi)皮生長因子(VEGF－C)及其受體(VEGFR－3)在喉癌組織中的表達(dá)及其與喉癌臨床病理特征的關(guān)系。方法:選取2012年5月至2014年5月在我院接受手術(shù)治療的喉癌患者30例并提取患者喉癌組織及癌旁組織，以及30例健康體檢者的正常組織。采用免疫組化染色法檢測VEGF－C和VEGFR－3在不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果:VEGF－C與VEGFR－3在喉癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織和正常組織(P＜0.01);VEGF－C與VEGFR－3在喉癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05);與腫瘤大小、病理分級(jí)等無關(guān)(P＞0.05);VEGF－C和VEGFR－3在喉癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.899，P＜0.01);淋巴管密度(LVD)隨VEGF－C和VEGFR－3表達(dá)增強(qiáng)而升高(F=9.833，P＜0.01)。結(jié)論:VEGF－C、VEGFR－3在喉癌組織中的異常表達(dá)可能與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。

喉 癌; 血管內(nèi)皮生長因子C; 血管內(nèi)皮生長因子受體; 淋巴管密度

喉癌(Laryngeal carcinoma)是耳鼻喉－頭頸外科常見的惡性腫瘤之一，近年來的發(fā)病發(fā)病率和復(fù)發(fā)率持續(xù)升高。喉癌可以采取手術(shù)治療、放化療及生物免疫治療，雖然可以緩解病情，但遠(yuǎn)期療效并不理想，患者的生存質(zhì)量沒有獲得明顯改善［1］。目前普遍認(rèn)為，臨床分期是影響喉癌患者預(yù)后的主要因素。但有研究表明，淋巴管生成在惡性淋巴侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用［2］。血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF－C)及其受體(VEGFR－3)的異常表達(dá)可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成，刺激淋巴管擴(kuò)張［3］。為了探究VEGF－C和VEGFR－3的表達(dá)與喉癌臨床特征的關(guān)系，本研究采用免疫組化法檢測喉癌組織中VEGF－C、VEGFR－3的表達(dá)情況，為預(yù)防喉癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料:選取2012年5月至2014年5月在我院手術(shù)的30例喉癌患者的腫瘤組織、癌旁組織(距腫離瘤切緣＞0.5cm)，所有標(biāo)本均經(jīng)病理診斷證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌，癌旁組織經(jīng)病理證實(shí)為炎癥和正常組織，患者術(shù)前均未接受過放化療或其他治療。選擇同期我院接受手術(shù)治療30例患者正常喉黏膜組織標(biāo)本作為對(duì)照。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法:應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法:所有標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定、石蠟包埋，常規(guī)4μm制成連續(xù)切片，用二甲苯脫去蠟、梯度乙醇脫水。用新鮮配置3%的甲醇過氧化氫處理;VEGF－C、VEGFR－3和D2－40均采用枸櫞酸緩沖液修復(fù)抗原;加一抗(稀釋濃度VEGF－C、VEGFR－3為1:100，D2－40為1:50)，加入山羊血清，4℃下孵育過夜;PBS沖洗，加二抗10min，三抗10min，PBS沖洗，加DAB液顯色，加入蘇木素復(fù)染，梯度乙醇水化、加入二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察細(xì)胞染色。

1.3 判定方法:由兩位病理科醫(yī)師在未知臨床資料的情況下判定，將陽性著色細(xì)胞所占百分比與細(xì)胞著色強(qiáng)度結(jié)合進(jìn)行判定，得出陽性率。①陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為5個(gè)視野中陽性細(xì)胞的平均數(shù)占視野中細(xì)胞數(shù)的比例，陽性細(xì)胞率≤25%記為0分，26%～50%記為1分，51%～70%記為2分，＞70%記為3分。②按多數(shù)陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度計(jì)分:無色記為0分，多數(shù)陽性細(xì)胞呈淺棕黃記為1分，多數(shù)陽性細(xì)胞呈棕黃記為2分，多數(shù)陽性細(xì)胞呈棕褐記為3分，將以上兩項(xiàng)積分相加:0分為陰性，＞0分為陽性，并計(jì)算陽性百分率。③D2－40陽性淋巴管判斷標(biāo)準(zhǔn)及計(jì)數(shù)方法:參照Weidner方法進(jìn)行微淋巴管計(jì)數(shù)，在高倍鏡(400×)下觀察并對(duì)淋巴管進(jìn)行計(jì)數(shù)，每份計(jì)數(shù)4個(gè)視野，取其平均值為LVD (D2－40陽性脈管數(shù)/HP)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)采用SPSS13.0進(jìn)行分析處理，計(jì)數(shù)資料用(±s)表示，采用χ2檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)。應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析進(jìn)行相關(guān)性分析，以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 VEGF－C與VEGFR－3在不同組織中的表達(dá)情況:VEGF－C與VEGFR－3在喉癌組織、癌旁組織及正常組織中都有表達(dá)(H=38.66，H=36.33，P＜0.01)。VEGF－C與VEGFR－3在喉癌組織中的陽性表達(dá)率分別為73.5%和72.1%，均顯著高于癌旁組織和正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=32.06，P＜0.01;χ2=26.43，P＜0.01)。D2－40在喉癌組織中的表達(dá)為(8.14±3.21)，顯著高于癌旁組織和正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=29.71，P＜0.01)。VEGF－C、VEGFR－3及D2－40在癌旁組織和正常組織中的表達(dá)無顯著差異(t= 0.170，P＞0.05)。見表1。

表1 VEGF－C與VEGFR－3在喉癌組織、癌旁組織及正常組織中的表達(dá) n(%)

2.2 VEGF－C、VEGFR－3及D2－40的表達(dá)與喉癌病理特征的關(guān)系:30例喉癌標(biāo)本中，男18例，女12例;吸煙量＞400支/年的患者為14例，≤400支/年的為8例;癌腫直徑＞3cm的患者為24例，≤3cm的為6例;病理分級(jí):G1級(jí)7例，G2級(jí)13例，G3級(jí)10例;跨聲門型癌6例，聲門上型癌12例，聲門型癌12例;TNM期:Ⅰ期9例，Ⅱ期5例，Ⅲ期13例，Ⅳ期3例;淋巴轉(zhuǎn)移22例，無淋巴轉(zhuǎn)移8例。VEGF－C、VEGFR－3及D2－40的表達(dá)與臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移及臨床分型有關(guān)(P＜0.05)，與病理分級(jí)、吸煙史、腫瘤的大小和性別無關(guān)(P＞0.05)，見表2。

表2 VEGF－C與VEGFR－3在喉癌組織中的表達(dá)水平與臨床病理之間的關(guān)系

2.3 VEGF－C、VEGFR－3和 LVD的相關(guān)性分析: Spearman相關(guān)分析顯示，VEGF－C與VEGFR－3兩者表達(dá)率呈正相關(guān)(r=0.899，P＜0.01)。多元線性回歸分析顯示，LVD表達(dá)水平與VEGF－C和VEGFR－3呈正相關(guān)，而且隨VEGF－C與VEGFR－3表達(dá)增強(qiáng)而升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(YD=0.692XC+0.561XR－0.0663，F(xiàn)=9.833，P＜0.01)。

3 討 論

VEGF－C是用Flt4親和層析法分離得到與肝素結(jié)合的生長因子，可以促使血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖，促進(jìn)新生血管的形成［4］。VEGFR－3是酪氨酸蛋白激酶家族受體，屬于VEGF－C特異性受體，主要位于淋巴管的內(nèi)皮細(xì)胞［5］。D2－40是一種淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，可以特異地與癌胚抗原M2A結(jié)合［6］。

在正常情況下，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞為靜止?fàn)顟B(tài)，而在外傷、炎癥或者腫瘤情況下，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)遷移至局部組織并在生長因子作用下形成淋巴管［7］。癌細(xì)胞侵入到淋巴管被認(rèn)為是基于增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲性或是癌細(xì)胞產(chǎn)生消化酶對(duì)其基質(zhì)破壞，惡性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF－C與VEGFR－3結(jié)合后快速產(chǎn)生磷酸化，誘導(dǎo)胞質(zhì)內(nèi)信號(hào)的傳導(dǎo)，使DNA有絲分裂旺盛，引起淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增生，同時(shí)使淋巴管的通透性增強(qiáng)，因此腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的可能性也隨之增加。此外，惡性腫瘤細(xì)胞通過侵襲周邊病灶的淋巴管系統(tǒng)而進(jìn)入淋巴液，進(jìn)而形成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［8］。

大量研究表明，VEGF－C在多種腫瘤組織中比正常組織表達(dá)高［9］。有研究者在35個(gè)腫瘤標(biāo)本中共檢測到19個(gè)標(biāo)本具有VEGF－C mRNA的表達(dá)。還有研究證實(shí)，LVD可以作為乳腺癌、胃癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤淋巴管生成的重要指標(biāo)。近年來研究表明，VEGF－C及其受體VEGFR－3在癌組織中的高表達(dá)與LVD及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)正相關(guān)性。

結(jié)合本研究，VEGF－C與VEGFR－3在喉癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織和正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。我們推測，VEGF－C和VEGFR－3的表達(dá)與喉癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。研究還顯示，D2－40在喉癌組織中的表達(dá)為顯著高于癌旁組織和正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=29.71，P＜0.01)。結(jié)果提示，D2－40可能參與喉癌的發(fā)生和發(fā)展。此外，我們發(fā)現(xiàn)VEGF－C與VEGFR－3在喉癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)。說明VEGF－C和VEGFR－3的表達(dá)與腫瘤大小、病理分級(jí)、吸煙量及性別無相關(guān)性。這提示我們，VEGF－C可能通過多條信號(hào)通路激活活淋巴上皮細(xì)胞內(nèi)膜上的受體而引起腫瘤細(xì)胞淋巴管的增生。

我們推測，腫瘤細(xì)胞可能通過旁分泌途徑分泌VEGF－C，并與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上相關(guān)受體結(jié)合，使VEGFR－3酪氨酸酶產(chǎn)生磷酸化，導(dǎo)致腫瘤周圍淋巴管生成和擴(kuò)張，增加腫瘤轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的可能性。因此，深入研究淋巴管內(nèi)皮特異性標(biāo)記物D2－40，并通過阻斷VEGF－C和VEGFR－3信號(hào)傳導(dǎo)通路表達(dá)，可能會(huì)成為阻斷癌細(xì)胞經(jīng)淋巴道轉(zhuǎn)移的重要手段。但這一機(jī)制還需要我們?cè)诮窈蟮膶?shí)踐中深入探索。

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Expressions of VEGF－C and VEGFR－3 in Laryngeal Carcinoma and its Relationship with the Metastasis

XIA Bing， ZHAO Jun， WANG Naihui， et al
(Jianhu Hospital Affiliated to Nantong University，Jiangsu Jianhu224700，China)

Laryngeal carcinoma; VEGF－C; VEGFR－3; Lymphatic vessel density

B

10.3969/j.issn.1006－6233.2015.05.026

1006－6233(2015)05－0785－04

Abstract:Objective:To investigate the expressions of VEGF－C and VEGFR－3 in the tissues of laryngeal carcinoma and its relationship with the clinical pathology of tumor.Method:The tissues of laryngeal carcinoma and para－carcinoma of patients with laryngeal carcinoma treated in our hospital from May 2012 to 2014 were selected.And another 30 normal tissues of the healthy people were chosen as the control group.Then the expressions of VEGF－C and VEGFR－3 in different tissues were detected by immunohistochemical staining method.Result:The positive expressions of VEGF－C and VEGFR－3 in the laryngeal carcinoma were significantly higher than those of the tissues in para－carcinoma and the control group(P＜0.01);The expressions of VEGF－C and VEGFR－3 in laryngeal carcinoma were related to the clinical stages and lymph node metastasis(P＞0.05).There was no relevance of the expressions of VEGF－C and VEGFR－3 with tumor size or pathological grades(P＜0.05);There was positive correlation between the expressions of VEGF－C and VEGFR－3 in laryngeal carcinoma(r=0.899，P＜0.01);with the expressions of VEGF－C and VEGFR－3 upregulating，the LVD increasing(F=9.833，P＆lt;0.01).Conclusion:The abnormal expressions of VEGF－C and VEGFR－3 in laryngeal carcinoma may be associated with tumor metastasis.