GSK-3底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究進(jìn)展

羅亨全

(江漢油田總醫(yī)院精神衛(wèi)生科，湖北潛江433124)

GSK-3底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究進(jìn)展

羅亨全

(江漢油田總醫(yī)院精神衛(wèi)生科，湖北潛江433124)

GSK-3抑制劑;中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病;藥物設(shè)計(jì);L803-mts;阿爾茨海默病

糖原合成酶激酶-3（GSK-3）抑制劑已成為治療神經(jīng)退行性疾病和精神障礙性疾病的有效方法。盡管多種GSK-3抑制劑已經(jīng)在細(xì)胞水平和動(dòng)物模型試驗(yàn)中得到廣泛運(yùn)用，然而還需完善的是提高其特異靶向性。目前已經(jīng)認(rèn)識(shí)到對(duì)于長(zhǎng)期用藥來說選用中度效果的抑制劑比完全性抑制劑效果更佳。底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑具有高度選擇性，并能適度調(diào)控抑制效率?，F(xiàn)將近年來GSK-3底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的在治療方面的研究進(jìn)展綜述如下。

1 GSK-3在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用

糖原合成酶激酶-3（GSK-3）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中起著重要調(diào)控作用，這一認(rèn)識(shí)得益于通過研究經(jīng)典的情緒穩(wěn)定劑鋰離子的作用底物，發(fā)現(xiàn)它可以抑制GSK-3β的活性[1,2]，從而開啟了GSK-3在精神系統(tǒng)功能的廣泛研究。由于情緒行為的改變與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系密切，所以人們很快又轉(zhuǎn)向了對(duì)于CNS中GSK-3信號(hào)通路的研究。研究證實(shí)GSK-3參與了多數(shù)神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生，譬如帕金森氏癥、肌萎縮性側(cè)索硬化癥（ALS）、多發(fā)性硬化綜合癥、阿爾茨海默氏?。ˋD），以及腦髓老化等[3-6]。轉(zhuǎn)基因小鼠中增強(qiáng)GSK-3活性導(dǎo)致記憶缺損、大腦萎縮、以及行為與交互能力減弱[7]，最終出現(xiàn)阿爾茨海默氏病的特征，譬如Tau蛋白高度磷酸化濃度及β淀粉樣蛋白積聚[8]。藥物抑制劑或選擇性GSK-3基因敲除也證實(shí)GSK-3參與對(duì)于腦質(zhì)形態(tài)、神經(jīng)元可塑性以及精神行為的調(diào)控[6]。

目前在臨床上也發(fā)現(xiàn)AD、ALS、多數(shù)抑郁癥、精神分裂癥和躁狂抑郁癥患者都有GSK-3的活性調(diào)控的異常[6,7,9]，其發(fā)病機(jī)制可能與一些受GSK-3直接或間接調(diào)控的靶蛋白有關(guān)，包括tau蛋白、老素、β淀粉樣蛋白、腦衰蛋白反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白、Wnt信號(hào)通路、β-連環(huán)蛋白和熱休克蛋白等[3,6]。近期研究表明GSK-3參與炎癥反應(yīng)，此一作用可能與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)。GSK-3可激活各種免疫應(yīng)答通路，如Toll樣受體，轉(zhuǎn)錄因子NF-кB，環(huán)狀A(yù)MP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，以及其他參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子產(chǎn)生的通路[10,11]。另外，最近發(fā)現(xiàn)GSK-3可負(fù)向調(diào)控溶酶體功能，降低其對(duì)神經(jīng)毒性集聚體的清除，譬如AD大腦中的Aβ集聚體[12,13]。由此可見，使GSK-3活性回歸正?；侵委熒窠?jīng)退行性疾病和行為障礙疾病的有效方法，并且已有多個(gè)動(dòng)物模型證明GSK-3抑制劑有良好的療效。

有關(guān)GSK-3小分子抑制劑的報(bào)道量在不斷的增加，很多已經(jīng)進(jìn)行了動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)，都證實(shí)在生理?xiàng)l件和病理狀態(tài)下GSK-3都起著調(diào)控神經(jīng)元的作用。GSK-3抑制劑在神經(jīng)保護(hù)、干細(xì)胞自我復(fù)制和多能轉(zhuǎn)化、神經(jīng)觸突調(diào)控和精神行為等方面都具有顯著的保護(hù)作用[14]。目前公開發(fā)表的GSK-3抑制劑有不同的化學(xué)類型，而且作用機(jī)制各異：包括天然產(chǎn)物、金屬陽(yáng)離子、人工合成小分子化合物和多肽[14]。大多數(shù)抑制劑其作用機(jī)制是通過與GSK-3的ATP結(jié)合位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合而抑制其對(duì)底物的磷酸化作用。因?yàn)槎鄶?shù)蛋白激酶ATP結(jié)合位點(diǎn)屬于高度保守的序列，ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑通常特異性較差[15]，導(dǎo)致在臨床前期或早期臨床試驗(yàn)中，由于GSK-3抑制劑存在嚴(yán)重的毒副作用而失敗，為此，在開發(fā)和設(shè)計(jì)特異性蛋白激酶抑制劑方面要有獨(dú)創(chuàng)性。

GSK-3普遍存在于所有的真核細(xì)胞中，在哺乳動(dòng)物中有GSK-3α和GSK-3β兩種亞型，他們的催化區(qū)域氨基酸序列同源性高達(dá)98%，而蛋白兩端的同源性僅36%，不過他們?cè)诠δ芊矫婢哂懈叨裙残訹6,10]。在AD疾病模型中抑制GSK-3α比抑制GSK-3β的效果更好[16]，可能與他們有不同的亞細(xì)胞定位及與不同的蛋白相互作用有關(guān)。一般的GSK-3抑制劑并不能區(qū)分這兩個(gè)亞型，但是最近已有具有高選擇性GSK-3α抑制劑的報(bào)道[17]，但它們對(duì)于生理方面的影響還需進(jìn)一步探索，顯然，徹底闡明GSK-3同工酶的獨(dú)特生理功能對(duì)開發(fā)全新特異性抑制劑將起到至關(guān)重要的作用。

2 底物競(jìng)爭(zhēng)性GSK-3抑制劑

為了獲得蛋白激酶特異性抑制劑，一種方法是根據(jù)底物結(jié)合位點(diǎn)的不同特征來實(shí)現(xiàn)對(duì)靶目標(biāo)的選擇性抑制。雖然針對(duì)底物結(jié)合位點(diǎn)來設(shè)計(jì)抑制劑的方法還沒有得到廣泛應(yīng)用，但它不失為設(shè)計(jì)新型GSK-3抑制劑的好方法。長(zhǎng)期以來，人們都認(rèn)為底物競(jìng)爭(zhēng)抑制劑的弱點(diǎn)是與靶蛋白結(jié)合能力較弱，但目前認(rèn)為，結(jié)合能力較強(qiáng)的蛋白激酶抑制劑在體內(nèi)應(yīng)用系統(tǒng)中往往產(chǎn)生強(qiáng)烈不良反應(yīng)。在需要長(zhǎng)期給藥的治療過程中，適度抑制蛋白激酶的活性可能會(huì)獲得所需的療效，同時(shí)減少副作用的發(fā)生，在設(shè)計(jì)GSK-3抑制劑方面此點(diǎn)可能尤為突出。GSK-3是細(xì)胞維持正常功能所必須的，強(qiáng)效抑制劑往往導(dǎo)致細(xì)胞損傷，GSK-3基因敲除小鼠出現(xiàn)胚胎死亡已經(jīng)證明了這一結(jié)論[18]。此外，GSK-3的病理性激活狀態(tài)與正常水平相比增加不超過2～3倍，因此，在GSK-3活性升高相關(guān)的疾病中可能只需要抑制其活性到中等至更低（約50%）水平，而底物競(jìng)爭(zhēng)性GSK-3抑制劑則具有高選擇性和低毒性。

3 底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的設(shè)計(jì)與開發(fā)

GSK-3和其它蛋白激酶相比存在許多不同，與設(shè)計(jì)特異性抑制劑相關(guān)的GSK-3獨(dú)特性在于它要求底物的預(yù)磷酸化。GSK-3的底物都有共同的S1XXXS2(p)序列，其中S1位點(diǎn)被GSK-3磷酸化，S2是一個(gè)調(diào)節(jié)位點(diǎn)，需要先被其他激酶磷酸化，將S2(p)位點(diǎn)突變?yōu)榱姿峄野彼釟埢蚬劝彼崮茱@著減少底物被GSK-3的磷酸化水平[19]。人源GSK-3晶體結(jié)構(gòu)研究表明它含有一個(gè)由Arg96、Arg180和Lys205三個(gè)堿性氨基酸組成的結(jié)合域，它能與陽(yáng)離子以及預(yù)磷酸化的底物相結(jié)合。另外一個(gè)很重要的酶活性調(diào)節(jié)區(qū)域是位催化活性區(qū)域內(nèi)的酪氨酸的自磷酸化（GSK-3β中的酪氨酸216，GSK-3-α中的酪氨酸279），這個(gè)自磷酸化依賴于伴侶蛋白的輔助[20]。此外，其氨基末端區(qū)域有一個(gè)高度保守的序列（RPRTTSF），磷酸化后的這一保守序列充當(dāng)贗品底物而導(dǎo)致激酶活性下降[21]。這三要素控制著GSK-3激酶活性，在設(shè)計(jì)抑制劑時(shí)要充分考慮這三個(gè)特點(diǎn)。

利用GSK-3識(shí)別預(yù)磷酸化底物的特點(diǎn)，可以使用人工合成多肽的方法設(shè)計(jì)底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。依據(jù)GSK-3β氨基末端假底物序列衍生的磷酸化多肽對(duì)GSK-3抑制效用很弱[21]。相反，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白-1衍生肽L803具有強(qiáng)效抑制作用[22]。在L803氨基末端附加肉豆蔻酸短肽后（L803-mts）使其具備細(xì)胞穿膜功能[22]、水溶性極好、GSK-3高選擇性和血清穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)。在小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，組織病理學(xué)和單劑最大耐受量分析顯示其毒性作用很小。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和神經(jīng)元細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中L803-mts均有生物活性，對(duì)帕金森氏癥誘導(dǎo)劑6-羥基多巴胺和trisialoganglioside-GT1b導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用[23,24]。在強(qiáng)迫游泳癥和腦外傷小鼠運(yùn)用用L803-mts處理后有抗抑郁的效果，L803-mts還能改善內(nèi)神經(jīng)元β淀粉樣肽的負(fù)載，在阿爾茨海默氏癥小鼠模型中提高其認(rèn)知能力[12]。與其他的GSK-3抑制劑相比，L803-mts對(duì)于神經(jīng)毒性較低[12,25,26]。

目前L803的臨床前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果較好，其后期臨床運(yùn)用也充滿希望。用計(jì)算機(jī)輔助方法，依照其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，結(jié)合蛋白突變和功能分析研究，結(jié)果表明GSK-3β與底物的結(jié)合位點(diǎn)位于Phe67、Gln89、Phe93和Asn 95[19]。Phe67位于P環(huán)，屬于蛋白激酶家族中最保守的位點(diǎn)，此位點(diǎn)的突變使酶活性完全消失[12]。Gln 89、Phe93和Asn95位于“89-95結(jié)合環(huán)”，此區(qū)域在脊椎動(dòng)物中也是高度保守[27]，這一結(jié)合環(huán)和P環(huán)一起形成GSK-3底物結(jié)合域，Gln89和Asn95位于結(jié)合域底部，Phe93則完全暴露在外，位于磷酸基團(tuán)結(jié)合點(diǎn)的對(duì)面[27]，因此GSK-3的底物識(shí)別特異性取決于易于與廣泛底物結(jié)合的89-95結(jié)合環(huán)，以及其對(duì)底物預(yù)磷酸化的嚴(yán)格選擇性。

L803-m ts研究表明，該抑制劑與天然底物比較具有相似點(diǎn)，但與GSK-3β無重疊性相互作用。與其他底物相同的是L803-mts結(jié)合于磷酸基團(tuán)結(jié)合域，但不同的是L803-mts并不與Gln89或Asn95結(jié)合。L803-mts與89-95環(huán)的Phe93緊密結(jié)合，也與位于羧基末端的朝向ATP結(jié)合域的“疏水補(bǔ)丁”（纈氨酸214，異亮氨酸217和Tyr216）相互作用[27]。目前認(rèn)為，GSK-3底物和底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑與GSK-3的結(jié)合通過不同幾何形狀的底物結(jié)合槽相互作用，這種不同的結(jié)合模式提高了底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的特異性，例如，在水溶性環(huán)境中，疏水性相互作用比極性和電荷的相互作用具有更有高的能量強(qiáng)度，有利于阻止該抑制劑與激酶蛋白疏水片區(qū)的解離。

4 底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的改進(jìn)

L803-mts與GSK-3β結(jié)合的立體構(gòu)象依賴疏水性結(jié)合，這一發(fā)現(xiàn)提示通過增加多肽的疏水性可能會(huì)加強(qiáng)其抑制效果。實(shí)驗(yàn)證明，用丙氨酸或脯氨酸代替L803-mts的極性氨基酸谷氨酰胺（第9位）使其抑制效能分別增加4和10倍[27]。為了進(jìn)一步研究L803的結(jié)合模式，我們使用ANCHORSmap方法繪制了GSK-3表面氨基酸側(cè)鏈的優(yōu)先結(jié)合位點(diǎn)[28]，這種分析表明，帶正電荷的結(jié)合域極傾向與帶負(fù)電荷氨基酸殘基結(jié)合（如GLU），而89-95環(huán)附近的結(jié)合域則與多種氨基酸結(jié)合（譬如精氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酰胺，亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸等）。計(jì)算機(jī)模擬研究還顯示GSK-3β的苯丙氨酸93與L803的其他氨基酸殘基結(jié)合，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在L803-mts羧基末端加上苯丙氨酸殘基（L803F-mts）能使則其抑制效果提高2倍27。

蛋白激酶底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑在治療各種疾病中具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。本文所介紹的抑制劑比傳統(tǒng)的ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑相比有許多優(yōu)點(diǎn)，其中重要的是其高選擇性，而且能夠達(dá)到適度抑制的效果，這些優(yōu)點(diǎn)對(duì)于處理GSK-3活性增加相關(guān)疾病時(shí)尤為重要，因?yàn)檫@些抑制劑可以適度降低病理組織中GSK-3的過度激活，又可以避免對(duì)正常組織中GSK-3功能產(chǎn)生影響，降低毒負(fù)作用。目前已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，要設(shè)計(jì)更有效的底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，不能完全依賴底物間相互作用，還要充分考慮蛋白激酶與底物或與底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑結(jié)合的空間構(gòu)象方面的差異。生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和計(jì)算機(jī)模擬方法相結(jié)合，已經(jīng)用于設(shè)計(jì)有效的GSK-3抑制劑，這些抑制劑能像底物一樣與蛋白激酶相結(jié)合，但其與蛋白激酶的結(jié)合模式與底物完全不同。

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2004-11-23