廣西漢族人群NPC1L1基因1 735C＞G多態(tài)性分布特征及與血脂、肥胖的關(guān)系＊

苗 林，尹瑞興，吳東峰

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣西柳州545005；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，南寧530021；3.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院綜合干部病區(qū)，南寧530021）

血脂代謝紊亂和肥胖是動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病發(fā)生、發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素［1－2］。尼曼－匹克 C1樣1（NPC1L1）蛋白是膽固醇跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵物質(zhì)，在小腸中高度表達(dá)，影響腸道膽固醇的吸收，以及調(diào)節(jié)其他血脂代謝基因的活性，對全身膽固醇穩(wěn)態(tài)起著關(guān)鍵的調(diào)控作用［3－4］。研究顯示，NPC1L1基因多態(tài)性對其蛋白功能具有重要生物學(xué)效應(yīng)，從而影響膽固醇的水平［5－11］。本文研究 NPC1L1基因1 735C＞G（rs2072183）多態(tài)性位點(diǎn)對血脂水平和肥胖的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 在廣西羅城縣采用分層隨機(jī)整群抽樣的方法組建了漢族人群標(biāo)本庫，從中隨機(jī)抽取409名漢族人群作為研究對象。其中男155例，女254例。排除有心臟病史、中風(fēng)史，糖尿病或空腹血糖水平大于或等于7.0mmol/L者，及正在使用他汀類、貝特類、膽固醇吸收抑制劑（如依澤麥布片）、激素等影響血脂代謝相關(guān)藥物者。納入研究前患者均簽署知情同意書。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會許可。

1.2 方法 體檢項(xiàng)目：由專門人員測量身高、體質(zhì)量、腰圍和血壓等，并計(jì)算出BMI。?？漆t(yī)師詢問既往病史及生活習(xí)慣。血標(biāo)本采集及生化指標(biāo)檢測：禁食12h，清晨空腹，坐位采取靜脈血8mL，離心獲取血清。血清總膽固醇（TC）和三酰甘油（TG）的檢測采用標(biāo)準(zhǔn)酶法；血清高密度脂蛋白膽固醇（HDLC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL－C）采用酶聯(lián)免疫一步法測定，載脂蛋白 A－I（ApoA－I）和載脂蛋白B（ApoB）采用免疫透射比濁法。均在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)中心統(tǒng)一測定。DNA提取及PCR擴(kuò)增：取靜脈血3mL，采用苯酚－氯仿法提取基因組 DNA［12］。上游引物：5′－GGG ATG ACA GAT AGC ACC AA－3′，下 游 引 物：5′－GAC ATC ACC TTC CAC CTC TTG－3′。PCR反應(yīng)體系為25μL：2.0μL模板DNA，12.5μL2×Taq PCR MasterMix（北京天根生物公司），上下游引物各1.0μL（10μmol/L），不足部分去離子水補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)30次；最后72℃延伸8min。PCR產(chǎn)物使用TaqⅠ內(nèi)切酶酶切?？偡磻?yīng)體系10μL：PCR產(chǎn)物5μL，TaqⅠ5U（Fermentas公司），10×Buffer 1μL，不足體積去離子水補(bǔ)足，65℃水浴12h，2.0%瓊脂糖凝膠－核酸染料GELVIEW染色，100V電泳40min，紫外線下觀察、攝影。將PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物與DNA片斷長度標(biāo)準(zhǔn)物比較以鑒定基因型。PCR產(chǎn)物為437bp；野生基因型CC酶切產(chǎn)物為2條帶，分別為169 bp和268bp；突變型GG為437bp；雜合型CG則為3條帶，分別是437、169、268bp。隨機(jī)抽取3種基因型PCR產(chǎn)物經(jīng)上海生工測序證實(shí)。

表1 研究對象男女組間一般情況比較

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，兩樣本均數(shù)間的比較用t檢驗(yàn)，TG水平不符合正態(tài)分布，采用中位數(shù)及四分位間距表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)。所有基因型的Hardy－Weinberg平衡采用頻數(shù)分布擬優(yōu)合度的χ2檢驗(yàn)；不同基因型間血脂水平比較用協(xié)方差分析（ANCOVA）；用多重線性回歸分析基因型及性別、年齡、血壓、血糖、飲酒、吸煙等環(huán)境因素與血脂水平和BMI的關(guān)系，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況比較 男性具有較高的BMI、腰圍、收縮壓、舒張壓、TC、TG、LDL－C、ApoB水平和較低的 HDL－C水平（P＜0.05）。兩組間年齡、血糖和ApoA－Ⅰ水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，男性中吸煙和飲酒比例明顯高于女性（P＜0.05）。見表1。

2.2 電泳結(jié)果 NPC1L1基因rs2072183多態(tài)性的突變電泳圖譜，1條帶（437bp）為突變純合子，2條帶（169、268bp）為野生純合子，3條帶（437、169、268bp）為雜合子。測序證實(shí)，見圖1、2。

圖1 PCR產(chǎn)物酶切后電泳結(jié)果

圖2 3種基因型測序圖

表2 不同基因型各項(xiàng)指標(biāo)的比較（±s）

表2 不同基因型各項(xiàng)指標(biāo)的比較（±s）

基因型 n TC（mmol/L）TG［M（QR2），mmol/L］HDL－C（mmol/L）LDL－C（mmol/L）ApoA－Ⅰ（g/L）ApoB（g/L） BMI（kg/m2）21±3.71 CG 188 5.07±1.12 1.07（0.79） 1.77±0.62 2.99±0.87 1.34±0.26 0.87±0.19 22.10±2.87 GG 60 5.13±1.05 0.99（1.35） 1.69±0.46 3.11±1.03 1.30±0.23 0.89±0.21 23.39±3.49 F 1.501 0.280 1.167 4.678 0.358 3.917 3.312 P CC 161 4.88±0.94 1.07（0.90） 1.70±0.40 2.73±0.75 1.34±0.25 0.82±0.19 22.0.224 0.869 0.312 0.010 0.699 0.021 0.037

2.3 基因分布 NPC1L1基因rs2072183多態(tài)性在廣西漢族人群中的分布符合Hardy－Weinberg平衡。409例研究對象中CC、CG、GG基因型的分布頻率為39.40%、46.00%、14.60%，C和G等位基因頻率分別為62.35%和37.65%。男女之間基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 NPC1L1基因型與血脂水平和BMI的關(guān)系 3種基因型間LDL－C、ApoB和BMI水平存在顯著差異。G等位基因攜帶者具有較高的LDL－C和ApoB水平，CC和CG/GG組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。GG基因型具有較高的BMI，但G等位基因攜帶組與CC組比較，BMI差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.5 血脂和BMI相關(guān)因素分析 多元線性回歸分析顯示血脂和BMI與多種環(huán)境因素有著密切關(guān)系（P＜0.05），僅LDLC及ApoB水平與基因型有相關(guān)性（P＜0.05）。BMI未發(fā)現(xiàn)與基因型有相關(guān)性，見表3。

表3 血脂和BMI相關(guān)因素分析

續(xù)表3 血脂和BMI相關(guān)因素分析

3 討 論

NPC1L1蛋白作為依澤麥布的作用靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)腸腔內(nèi)膽固醇的吸收而為人熟知。NPC1L1蛋白主要分布于小腸上皮細(xì)胞的刷狀緣和肝細(xì)胞內(nèi)，在結(jié)構(gòu)上具有13個(gè)跨細(xì)胞膜區(qū)和固醇感知區(qū)域［13］。NPC1L1基因定位于染色體7p133，包括20個(gè)外顯子，19個(gè)內(nèi)含子［13］。研究發(fā)現(xiàn)，該基因單核苷酸基因多態(tài)性（SNP）影響膽固醇的吸收及血脂水平。1 735C＞G多態(tài)性位于第2外顯子的編碼區(qū)，關(guān)于其多態(tài)性分布特征，以及是否與血脂水平和肥胖相關(guān)的研究較少。

本研究發(fā)現(xiàn)，中國廣西漢族人群G等位基因頻率為37.65%，GG、GC和 CC基因型頻率分別為14.60%、46.00%和39.40%，男女之間等位基因分布無差異。廣西漢族G等位基因和GG基因型頻率與臺灣人群的35.7%、10.71%和上海地區(qū)漢族人群的37.3%、12.6%非常相似［7，14］，但均低于日本人群的41.90%和19.01%［9］。與歐美人群比較［11］，在高加索白人、美籍黑人和西班牙人群中，突變基因G頻率分別為21.9%、28.3% 和17.9%，明顯低于亞洲人群。這提示G等位基因的突變具有顯著的種族差異性。

Teslovich等［15］進(jìn)行的多中心的 GWAS研究發(fā)現(xiàn)NPC1L1基因變異與血脂代謝顯著相關(guān)，rs2072183多態(tài)性對血清TC和LDL－C水平有著重要影響。本研究顯示rs2072183多態(tài)性不僅對血脂水平，而且對BMI也有著重要影響。G等位基因攜帶者的血清LDL－C和ApoB水平顯著高于CC基因型組（P＜0.05），多元線性回歸分析亦表明LDL－C和ApoB和基因型有相關(guān)性。這和Polisecki等［8］在歐洲老年人中的研究結(jié)果一致，但卻和在其他亞裔人群的研究結(jié)果有所不同。Maeda等［9］在日本人群的研究顯示突變基因G對血清TC，HDL－C，LDL－C和 ApoB水平無顯著性影響，但 GG可升高菜油甾醇（膽固醇吸收的標(biāo)志）的水平，提示G等位基因可增加腸腔內(nèi)膽固醇的吸收，從而增加動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)。Zhao等［5］研究發(fā)現(xiàn)基因1 735C＞G多態(tài)性位點(diǎn)尚通過形成單倍體影響血脂水平，比如單體型－18A－1735C－U328650A＞G較其他單體型的血清LDL－C基礎(chǔ)水平低1.8mg/dL。綜上可見，NPC1L1基因1 735C＞G多態(tài)性對血脂代謝有著重要影響，攜帶突變等位基因G的人群可能有著較高的血脂水平，但在不同種族中其對血脂譜的影響不同。多因素分析顯示多種環(huán)境因素與血脂譜相關(guān)，這種差異性也可能與環(huán)境因素或環(huán)境－基因相互作用對血脂譜的影響有關(guān)。

研究顯示NPC1L1基因敲除小鼠可避免肥胖［16］，但研究未得到一致結(jié)果［17］。BMI作為肥胖的重要衡量指標(biāo)，本研究表明，3種基因型間BMI水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且GG基因有著較高的BMI水平。但合并GG/GC后這種差異性消失，多元回歸分析亦未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。該結(jié)果提示NPC1L1基因1 735C＞G多態(tài)性可能影響肥胖的發(fā)生，但其是否為肥胖易感基因或是通過增加膽固醇的吸收而影響有待進(jìn)一步研究。

不可否認(rèn)，本研究存在一定局限性。（1）本研究共入選了409例某一地區(qū)漢族人群，樣本量小、單一，尚需在大樣本、不同種族人群中進(jìn)行驗(yàn)證。（2）本研究僅探討了NPC1Ll基因單個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與血脂譜和BMI的關(guān)系。由于單個(gè)位點(diǎn)的微小性，以及基因－基因和基因－環(huán)境因素的相互影響，可能導(dǎo)致與其他結(jié)果的不一致，尚需進(jìn)一步研究多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。（3）進(jìn)一步開展機(jī)制和功能方面的研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，NPC1L1基因1 735C＞G多態(tài)性在中國漢族人群中廣泛存在，具有顯著的種族差異性。該基因突變位點(diǎn)G可能是高LDL－C水平和肥胖的一個(gè)危險(xiǎn)因素。

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