沙眼衣原體持續(xù)感染狀態(tài)下STAT3-TLR2 信號(hào)軸的變化初探①

陳純靜 陳 恩 林 琳 羅奇志 李 偉 余 平 (中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，長沙 410008)

沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis，Ct)是一類嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭陰性原核細(xì)胞微生物，也是最常見的性傳播性疾病(Sex transmitted disease，STD)的病原體之一。Ct 在宿主的持續(xù)感染可引起尿道炎、盆腔炎、異位妊娠、輸卵管性不孕等多種疾?。?-3］。雖然Ct 的感染可用抗生素進(jìn)行有效治療，但由于感染后癥狀不明顯而延誤診治，常導(dǎo)致持續(xù)性感染(Persistent infection)［2］。因此，研究Ct 持續(xù)性感染的分子機(jī)制和機(jī)體的防御反應(yīng)將為防治Ct持續(xù)感染提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Ct 在感染的黏膜和上皮細(xì)胞內(nèi)呈特殊的二相發(fā)育周期。有感染性、無分裂能力的原體(Elementary body，EB)通過內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞，形成包涵體，在包涵體內(nèi)EB 增大為無感染性但具分裂能力的網(wǎng)狀體(Reticulate body，RB)，RB 以二分裂方式增殖并分化成新的EBs，然后EBs 從細(xì)胞釋放再次感染新的宿主細(xì)胞，整個(gè)發(fā)育周期約需48～72 h［4］。研究表明，在γ-干擾素(Interferon γ，IFN-γ)作用下，Ct 在宿主細(xì)胞內(nèi)形成非典型感染狀態(tài)，盡管包涵體依然存在，但無感染能力。電鏡下表現(xiàn)為包涵體內(nèi)出現(xiàn)大量形態(tài)異常增大、疏松的RB，未見或極少見成熟的 EB［5，6］。低 濃 度 的 IFN-γ(0.2 ng/ml)可引起Ct 的持續(xù)性感染，其機(jī)制主要是誘生了吲哚加雙氧酶(Indoleamine dioxygenase，IDO)，通過降低細(xì)胞內(nèi)色氨酸含量而抑制Ct 的生長發(fā)育［5，7］。但在Ct 持續(xù)性感染狀態(tài)下，如何發(fā)生免疫反應(yīng)引起炎性損傷尚未見相關(guān)報(bào)道。

在炎性細(xì)胞因子中，IL-6 是具有最廣泛生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子之一，有明顯的促炎并導(dǎo)致組織病理損傷的作用。在Ct 感染后，尤其是在持續(xù)感染狀態(tài)下，上皮細(xì)胞持續(xù)高表達(dá)IL-6［8］。IL-6 可通過活化細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal transducer and activator of transcription，STAT)而發(fā)揮生物學(xué)作用。分泌至細(xì)胞外的IL-6 與其細(xì)胞膜受體結(jié)合后活化STAT3，二聚化的STAT3 進(jìn)入核內(nèi)啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，參與細(xì)胞增殖反應(yīng)、急性炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡等［9］。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在Ct 持續(xù)感染狀態(tài)下，IL-6 的表達(dá)和分泌水平明顯增高，同時(shí)STAT3 的基因表達(dá)水平也明顯增高［10］。有理由推測，在Ct 持續(xù)感染期間，異常分泌的IL-6 進(jìn)一步活化了STAT3，從而引起炎性反應(yīng)和組織損傷，但STAT3 活化后的下游信號(hào)如何發(fā)揮作用尚不清楚。在人類支氣管上皮細(xì)胞中，dsRNA 可誘導(dǎo)細(xì)胞因子IL-6 的分泌，IL-6通過活化STAT3 上調(diào)TLR2 的表達(dá)參與炎癥反應(yīng)［11］。Tye 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，在胃上皮細(xì)胞中STAT3可以作用于TLR2 基因，直接上調(diào)上皮細(xì)胞TLR2 的表達(dá)，引起IL-6 和IL-1 分泌增加。提示在上皮細(xì)胞中存在著由IL-6 參與的STAT3-TLR2 信號(hào)軸的活化［13］。但是在Ct 持續(xù)感染的上皮細(xì)胞中，活化的STAT3 是否也參與了TLR2 信號(hào)通路的調(diào)控尚不清楚。

在本研究中，我們利用IFN-γ 構(gòu)建Ct 的持續(xù)性感染細(xì)胞模型，通過qRT-PCR、ELISA 和WB 等技術(shù)初步證實(shí):在Ct 持續(xù)感染細(xì)胞中存在著STAT3-TLR2 信號(hào)軸的異常變化，此結(jié)果為衣原體持續(xù)性感染致病機(jī)制的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 HeLa229 細(xì)胞株(人宮頸癌上皮細(xì)胞，ATCC#CCL-2.1)為本實(shí)驗(yàn)室保存。Ct 菌株(L2 血清型)由美國德克薩斯州健康科學(xué)中心鐘光明教授惠贈(zèng)。IFN-γ 購自Sigma;DMEM 培養(yǎng)基、小牛血清購自Hyclone;MMLV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermantas;qRT-PCR 試劑購自BioRad;TLR2、STAT3、p-STAT3兔抗人多克隆IgG 抗體購自Abcam 公司;β-actin 兔多克隆抗體購自Bioworld 公司;HRP-羊抗兔二抗購自北京康為世紀(jì);人IL-1α 的ELISA 試劑盒購自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和沙眼衣原體急性感染模型及持續(xù)性感染模型的建立

1.2.1.1 HeLa229 細(xì)胞用含有10% 小牛血清的DMEM 在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。參照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行Ct 感染、增殖、滴定、分裝的Ct 保存在-80℃。

1.2.1.2 建立Ct 急性感染模型:計(jì)數(shù)2 ×105個(gè)生長良好的HeLa 細(xì)胞，接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長至單層，按照前述方法感染Ct(MOI=5)，37℃、5%CO2培養(yǎng)。

1.2.1.3 建立Ct 持續(xù)性感染模型:計(jì)數(shù)2 ×105個(gè)生長良好的HeLa 細(xì)胞，接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長至單層后，按照前述方法感染Ct(MOI=5)。參照文獻(xiàn)和我們的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在2 h 后加入0.2 ng/ml 的IFN-γ，37℃、5%CO2培養(yǎng)。

1.2.1.4 本實(shí)驗(yàn)分別采用SPG 和IFN-γ 設(shè)計(jì)相應(yīng)的對照。

1.2.2 熒光定量PCR 技術(shù)檢測TLR2 轉(zhuǎn)錄水平 分別在Ct 急性感染及持續(xù)性感染HeLa 細(xì)胞6、24和48 h 后收集細(xì)胞樣本，同時(shí)收集相同時(shí)間點(diǎn)未感染細(xì)胞樣本作為對照，按使用說明書用TRIzol 法抽提總RNA。將RNA 樣本用MMLV 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，保存在-80℃。參考文獻(xiàn)并利用Primer2.0 及Primer-Blast 設(shè)計(jì)待測基因的引物用于qRT-PCR 檢測mRNA 表達(dá)量(表1)，采用△△Ct 法計(jì)算各目的基因mRNA 的表達(dá)變化。使用BioRad CFX manager 2.0 分析干預(yù)后差異基因的表達(dá)情況。

新型降血糖化合物G004的遺傳毒性與生殖毒性研究…………………………………………………… 蔡 鳴等（22）：3078

1.2.3 ELISA 檢測IL-1α 分泌水平 分別在Ct 急性感染及持續(xù)性感染HeLa 細(xì)胞6、24 和48 h 后收集培養(yǎng)上清，同時(shí)收集相同時(shí)間點(diǎn)未感染培養(yǎng)上清樣本作為對照，分裝后保存在-80℃。用雙抗夾心ELISA 方法檢測上清液中IL-1α 濃度。操作根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 Western blot 檢測蛋白的表達(dá) 利用含有蛋白酶和磷酸酶混合抑制劑的RIPA 細(xì)胞裂解液，分別在Ct 急性感染及持續(xù)性感染HeLa 細(xì)胞6、24 和48 h 后，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，隨后上樣進(jìn)行Western blot 實(shí)驗(yàn)，最后用48 h 后，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，隨后上樣進(jìn)行Western blot 實(shí)驗(yàn)，最后用ECL發(fā)光試劑盒檢測蛋白條帶。每次實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測相應(yīng)的β-actin(分子量46 kD)蛋白作為內(nèi)參對照。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 Sequence of qRT-PCR primers

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有資料均由三次獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得，數(shù)據(jù)使用SPSS13.0 軟件分析，采用獨(dú)立樣本的t 檢驗(yàn)，結(jié)果用±s 表示，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 采用低濃度IFN-γ 建立Ct 持續(xù)感染的HeLa細(xì)胞模型 本實(shí)驗(yàn)室已在前期研究中利用低濃度的IFN-γ 成功構(gòu)建了Ct 持續(xù)性感染HeLa 細(xì)胞模型［14］。在本研究中，用0.2 ng/ml IFN-γ 誘導(dǎo)Ct 持續(xù)性感染狀態(tài)。在Ct 感染48 h 后，電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，Ct 感染細(xì)胞內(nèi)的包涵體內(nèi)出現(xiàn)大量形態(tài)異常增大、疏松的RB，而未見成熟的EB(圖1B)。將Ct 直接感染HeLa 細(xì)胞，建立Ct 的急性感染HeLa 細(xì)胞，電鏡下觀察發(fā)現(xiàn):HeLa 細(xì)胞中的包涵體內(nèi)出現(xiàn)大量的體積小而致密的EB，同時(shí)含有少量的RB(圖1A)。表明Ct 持續(xù)性感染和急性感染細(xì)胞模型建立成功。

2.2 Ct 持續(xù)感染狀態(tài)下STAT3 的表達(dá)與活化增加

2.2.1 收集Ct 不同感染狀態(tài)的HeLa 細(xì)胞裂解液，采用Western blot 技術(shù)檢測STAT3 蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在Ct 急性感染狀態(tài)和持續(xù)性感染狀態(tài)下，與對照組相比，STAT3 表達(dá)明顯增加;在相同時(shí)間點(diǎn)，Ct 持續(xù)感染狀態(tài)下，細(xì)胞STAT3 蛋白較急性感染狀態(tài)細(xì)胞的表達(dá)增加更明顯。說明在Ct 的持續(xù)感染狀態(tài)下，STAT3 表達(dá)明顯增加(圖2)。

圖1 Ct 急性感染和持續(xù)性感染電鏡圖Fig.1 Electron microscope pictures of Ct acute infection and Ct persistent infection

圖2 Ct 不同感染狀態(tài)下STAT3 的蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of STAT3 protein in HeLa cells in different patterns of infection

圖3 Ct 不同感染狀態(tài)下STAT3 的活化Fig.3 Activation of STAT3 protein in HeLa cells in different patterns of infection

圖4 Ct 不同感染狀態(tài)下，HeLa 細(xì)胞中TLR2 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平Fig.4 Transcriptional level of TLR2 mRNA in HeLa cells in different patterns of infection

圖5 Ct 不同感染狀態(tài)下，HeLa 細(xì)胞TLR2 的表達(dá)Fig.5 Expression of TLR2 in HeLa cells in different patterns of infection

圖6 Ct 不同感染狀態(tài)下，HeLa 細(xì)胞IL-1α 的分泌水平Fig.6 Secretion level of IL-1α in HeLa cells in different patterns of infection

2.3 Ct 持續(xù)感染狀態(tài)下TLR2 的表達(dá)升高 收集Ct 不同感染狀態(tài)下的HeLa 細(xì)胞總RNA，利用qRTPCR 方法分別檢測不同時(shí)間點(diǎn)(6、24、48 h)，不同感染模式下的TLR2 的mRNA 表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與急性感染狀態(tài)相比，Ct 持續(xù)性感染的HeLa 細(xì)胞在24 h 和48 h，TLR2 轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)顯著性升高(圖4)。

2.4 Ct 持續(xù)感染狀態(tài)下TLR2 的表達(dá)增加 通過Western blot 技術(shù)檢測Ct 不同感染模式下細(xì)胞TLR2 的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):在Ct 感染HeLa 細(xì)胞的6 h，TLR2 的表達(dá)未有明顯的變化。在Ct 感染的24 h時(shí)，急性感染和持續(xù)性感染的細(xì)胞TLR2 表達(dá)均開始增加，持續(xù)性感染時(shí)表達(dá)更明顯。在IFN-γ 誘導(dǎo)的Ct 持續(xù)性感染48 h 后，HeLa 細(xì)胞的TLR2 表達(dá)出現(xiàn)了顯著的上調(diào)(圖5)，結(jié)果與其基因轉(zhuǎn)錄水平相一致。

2.5 Ct 持續(xù)感染狀態(tài)下IL-1α 的分泌升高 收集Ct 不同感染狀態(tài)的HeLa 細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用ELISA 方法檢測細(xì)胞因子IL-1α 的分泌水平。結(jié)果表明:在Ct 急性感染和持續(xù)性感染狀態(tài)下，特別是持續(xù)性感染48 h，炎性因子IL-1α 的分泌顯著增加(圖6)。

3 討論

IFN-γ 是重要的內(nèi)源性免疫和炎性介質(zhì)，在巨噬細(xì)胞活化、炎癥、防御胞內(nèi)菌、Th1 應(yīng)答中發(fā)揮重要作用［15，16］。IFN-γ 與其受體結(jié)合后，通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，啟動(dòng)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，參與多種生物學(xué)功能，如免疫調(diào)節(jié)、宿主防御、細(xì)胞周期、凋亡、炎癥等［16］。IFN-γ 既可防御細(xì)菌的急性感染，也能誘導(dǎo)細(xì)菌的持續(xù)性感染。IFN-γ 誘導(dǎo)的Ct 的持續(xù)感染與其濃度有關(guān)，高劑量的IFN-γ(2 ng/ml)可完全抑制Ct 的生長分化，而低劑量的IFN-γ(0.2 ng/ml)則引起Ct 的持續(xù)性感染［17］。我們利用0.2 ng/ml 的IFN-γ 建立了Ct 的持續(xù)感染HeLa 細(xì)胞模型。在Ct 持續(xù)感染48 h 后，電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Ct 持續(xù)性感染的HeLa 細(xì)胞中，其包涵體內(nèi)出現(xiàn)大量形態(tài)異常增大、疏松的RB，而成熟的EB 較少見［14］。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，在Ct 的持續(xù)性感染狀態(tài)下，HeLa 細(xì)胞分泌的IL-6 水平異常增高，這可能與IFN-γ 可以增強(qiáng)TLRs 誘導(dǎo)的IL-6 分泌有關(guān)，但具體的分子機(jī)制尚不完全清楚。分泌至細(xì)胞外的IL-6與其膜受體結(jié)合后通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以活化STAT3，STAT3 二聚化進(jìn)入核內(nèi)啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，參與細(xì)胞增殖反應(yīng)、急性炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡等［18］。在人類支氣管上皮細(xì)胞和胃上皮細(xì)胞中，均存在著由IL-6 活化的STAT3-TLR2 正反饋信號(hào)軸［12，19］。提示在上皮細(xì)胞中存在著IL-6 參與的STAT3-TLR2 信號(hào)軸的活化，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的分泌增加［13］。在IFN-γ 誘導(dǎo)的Ct 持續(xù)性感染中，細(xì)胞STAT3 的表達(dá)和活化明顯升高，其變化趨勢與IL-6 的轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達(dá)變化相一致。說明在Ct的持續(xù)性感染中，可能是IL-6 的異常分泌參與了STAT3 的活化。

此外，在Ct 持續(xù)性感染的48 h，TLR2 的基因和蛋白表達(dá)水平均顯著升高，與STAT3 的蛋白表達(dá)和活化增加趨勢一致，說明STAT3 的活化可能也參與了Ct 持續(xù)性感染狀態(tài)下上皮細(xì)胞TLR2 的表達(dá)上調(diào)，存在著STAT3-TLR2 信號(hào)軸的活化。在持續(xù)性感染的6 h 沒有明顯的TLR2 表達(dá)增加，持續(xù)感染24 h 時(shí)TLR2 的表達(dá)才開始增加。說明在Ct 持續(xù)性感染的早期TLR2 并沒有參與細(xì)胞炎性因子的分泌，可能是IFN-γ 或者其他的機(jī)制在感染的早期誘導(dǎo)了炎性細(xì)胞因子的分泌，TLR2 則主要在持續(xù)性感染的中晚期發(fā)揮作用。O'connel 發(fā)現(xiàn)在肺炎衣原體(Cp)感染后，細(xì)胞的活化需要MyD88 和TLR2 的參與，而且在感染的早期TLR2 即參與了促炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，進(jìn)而招募巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞向感染部位聚集［20］。與我們的研究結(jié)果并不一致，可能是因?yàn)镃t 與Cp 的結(jié)構(gòu)成分之間存在著差異和選用的感染靶細(xì)胞以及Ct 的感染狀態(tài)不同所致。

在Ct 感染的巨噬細(xì)胞中，有多種炎性細(xì)胞因子分泌，包括GM-CSF、TNF、IL-1α 和IL-6 等，IL-1α 和IL-6 通常被認(rèn)為是TLR2 的主要效應(yīng)分子［21］。我們的結(jié)果顯示，IL-1α 在Ct 持續(xù)感染的上皮細(xì)胞中分泌明顯增加，IL-1α 的分泌主要是在Ct 持續(xù)性感染的48 h 顯著增加，說明在Ct 持續(xù)性感染狀態(tài)下，TLR2 表達(dá)增加并誘導(dǎo)了其效應(yīng)分子IL-1α 的分泌。

總之，在IFN-γ 誘導(dǎo)的Ct 持續(xù)性感染狀態(tài)下，IL-6 引起了STAT3 的活化增加，同時(shí)上皮細(xì)胞TLR2 的表達(dá)明顯增加，TLR2 效應(yīng)分子IL-1α 也出現(xiàn)了過度分泌，存在著STAT3-TLR2 信號(hào)軸的活化。但STAT3 是否在誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子分泌中起著關(guān)鍵作用，而TLR2 又如何發(fā)揮作用，還需要我們進(jìn)一步研究。

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