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    探索靜水高壓在研制黑色素瘤疫苗方面的應(yīng)用

    2015-03-18 11:41:12劉澤強(qiáng)莊敏麗潘月海馬占川
    中國免疫學(xué)雜志 2015年8期
    關(guān)鍵詞:靜水乳化液黑色素瘤

    劉 凱 劉澤強(qiáng) 莊敏麗 潘月海 馬占川 劉 彬

    (吉林大學(xué)第一醫(yī)院,長春 130000)

    近年來黑色素瘤的發(fā)病率在全世界呈上升趨勢[1]。因此,黑色素瘤的防治已成為全球醫(yī)藥衛(wèi)生工作的重要任務(wù)。黑色素瘤易轉(zhuǎn)移、侵襲和復(fù)發(fā)等特性,使各種治療方法如手術(shù)、化療和放療均效果不佳。隨著人們對免疫系統(tǒng)認(rèn)識(shí)的深入,用免疫方法防治腫瘤成為了熱點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞表面抗原可被宿主的免疫系統(tǒng)所識(shí)別,運(yùn)用免疫佐劑增強(qiáng)腫瘤抗原的免疫原性,誘發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答,以達(dá)到防治腫瘤的目的[2,3]。

    細(xì)胞破碎可釋放腫瘤抗原。常用的細(xì)胞破碎方法有機(jī)械、非機(jī)械兩種。靜水高壓屬于機(jī)械破碎,其破壞腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu),使其失去增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的能力,但保留其免疫原性。細(xì)胞表面、胞內(nèi)蛋白經(jīng)高壓處理后可能會(huì)暴露相應(yīng)的亞單位,進(jìn)而增強(qiáng)免疫原性。本實(shí)驗(yàn)采用靜水高壓、液氮反復(fù)凍融不同細(xì)胞破碎方法制成腫瘤疫苗免疫小鼠,通過小鼠體內(nèi)熒光成像、DTH 實(shí)驗(yàn)等不同的指標(biāo)檢測,進(jìn)而比較兩種方法的優(yōu)劣性。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6J 純系小鼠30 只,SPF級,購買于北京維通利華生物技術(shù)有限公司。雌性,體重(22 ±2)克。飼養(yǎng)于吉林大學(xué)第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)院。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株 鼠源性B16 黑色素瘤細(xì)胞株,含有免疫熒光基因的鼠源性B16 黑色素瘤細(xì)胞株,由吉林大學(xué)第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)院贈(zèng)予。

    1.1.3 其他實(shí)驗(yàn)材料 DMEM 培養(yǎng)基(HyClone 公司),胰酶(HyClone 公司),PBS 溶液(LEAGENE 公司),臺(tái)盼藍(lán)染液,醫(yī)用三通,弗氏佐劑(Sigma 公司),普通顯微鏡(Olympus 公司),細(xì)胞培養(yǎng)箱(thermo 公司),熒光素酶底物(PEL 公司),小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)(Caliper 公司),凍存管(CIRNING 公司),超凈臺(tái)(thermo 公司),DH600-0.8X2(9242)靜壓機(jī)(上海大隆高壓設(shè)備制造廠)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 腫瘤疫苗的制備 將液氮罐中取出的B16黑色素瘤細(xì)胞復(fù)蘇及數(shù)次傳代后,取對數(shù)生長期的細(xì)胞,用0.25%胰酶消化細(xì)胞,離心后計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度為1.6 ×107ml-1。使用3 個(gè)柔軟的無菌套分別盛裝1ml 細(xì)胞懸液放入靜壓機(jī)中,200 mpa 壓力破碎細(xì)胞30 min[4]。分別吸取1 ml 懸液于3 個(gè)凍存管中,液氮浸泡3 min,37℃水浴3 min,反復(fù)3 次。將高壓破碎與凍融破碎的細(xì)胞液用臺(tái)盼藍(lán)染色,在普通光學(xué)顯微鏡下見兩組均無完整細(xì)胞。將1.5 ml高壓破碎細(xì)胞液與同體積完全弗氏佐劑分別抽吸于兩個(gè)5 ml 玻璃注射器中,三通聯(lián)接兩注射器,反復(fù)抽推30 min,充分乳化。另取凍融破碎的細(xì)胞懸液、PBS 溶液分別充分乳化[5]。乳化后將一滴乳化液滴入純水中,若30 min 不散開,則證明乳化完全。

    1.2.2 小鼠免疫 30 只小鼠打耳號,使用隨機(jī)數(shù)字表法分為6 組。每只小鼠背部皮下多點(diǎn)注射乳化液進(jìn)行免疫,每只小鼠注射乳化液100 μl[5]。第1、3 組注射高壓破碎乳化液,第2、4 組注射凍融破碎乳化液,第5、6 組注射PBS 乳化液。初次免疫后第14、28 天分別再次免疫,再次免疫使用不完全弗氏佐劑,劑量同前。

    1.2.3 小鼠腫瘤的接種及測量 最后一次免疫7 d后,用含有免疫熒光基因的鼠源性B16 黑色素瘤細(xì)胞接種小鼠。第1、3、5 組小鼠行尾靜脈注射濃度為1 ×106ml-1細(xì)胞懸液0.4 ml。第2、4、6 組小鼠在腹腔側(cè)方皮下注射相同濃度的細(xì)胞懸液0.1 ml。接種腫瘤后,每日觀察小鼠皮下是否長出瘤體。待長出瘤體后,用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑與寬徑,并記錄每組小鼠生存時(shí)間。

    1.2.4 DTH 反應(yīng) 采用足墊腫脹試驗(yàn)檢測特異性遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)。將小鼠進(jìn)行分組:高壓1組為高壓破碎免疫后尾靜脈注射腫瘤組,高壓2 組為高壓破碎免疫后皮下注射腫瘤組;凍融1 組為凍融破碎免疫后尾靜脈注射腫瘤組,凍融2 組為凍融破碎免疫后皮下注射腫瘤組;對照1 組為空白對照免疫后尾靜脈注射腫瘤組,對照2 組為空白對照免疫后皮下注射腫瘤組。小鼠在處死前1 d,于每只小鼠左前、后足墊分別注射1 ×105個(gè)(50 μl)細(xì)胞,24 h 后游標(biāo)卡尺測量左、右足墊厚度,以兩足墊厚度差計(jì)算腫脹反應(yīng)[5]。

    1.2.5 小鼠體內(nèi)免疫熒光成像 小鼠稱重,按小鼠每克體重10 μg 劑量腹腔注射氯胺酮。待麻藥起效后按小鼠每克體重10 μg 劑量腹腔注射熒光素酶(Luciferase)。將小鼠放入活體成像系統(tǒng)進(jìn)行體內(nèi)免疫熒光成像。曝光時(shí)間為1 min。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以±s 表示,組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn),P<0.05 表示兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 小鼠皮下腫瘤模型的建立 1 ×106ml-1的細(xì)胞液0.1 ml 接種于小鼠腹腔側(cè)方皮下,成功建立小鼠黑色素瘤腫瘤模型,建模后3 d 可觸摸到微小腫瘤結(jié)節(jié),第5 天成瘤明顯,成瘤率為100%。

    2.2 小鼠生存時(shí)間 小鼠生存時(shí)間為從接種腫瘤至小鼠死亡。由圖1 可見,高壓組小鼠生存時(shí)間最長,凍融組次之,而對照組最短。各組小鼠生存時(shí)間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    圖1 各組小鼠生存時(shí)間Fig.1 Survival time of each group of mice

    圖2 每組小鼠瘤體體積與生存期Fig.2 Tumor volume and survival time of each group of mice

    2.3 小鼠瘤體體積與生存期 隔日用游標(biāo)千分尺記錄腫瘤最長徑(L)和垂直方向最大橫徑(W),依照下列公式計(jì)算腫瘤體積V=LW2/2(式中,V 為腫瘤體積,L 為腫瘤最長徑,W 為腫瘤垂直方向的最大橫徑)。接種腫瘤至動(dòng)物死亡的時(shí)間為小鼠生存期。荷瘤時(shí)間以腫瘤可觸及時(shí)計(jì)算,直至動(dòng)物死亡[6,7]。如圖2 所示,自測量腫瘤第7 天開始,3 組腫瘤體積差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    2.4 DTH 實(shí)驗(yàn) DTH 實(shí)驗(yàn)是評價(jià)細(xì)胞免疫最直接、最常用的在體試驗(yàn),免疫效果可以通過產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)的強(qiáng)弱得到預(yù)測[5]。

    如圖所示,高壓1 組、高壓2 組、凍融1 組、凍融2 組與對照1 組、對照2 組之間存在顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。而高壓組與凍融組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P >0.05)。

    圖3 DTH 實(shí)驗(yàn)每組小鼠前爪鼠墊厚度差值Fig.3 Difference of pad thickness of paw in mice after DTH experiment

    圖4 DTH 實(shí)驗(yàn)每組小鼠后爪鼠墊厚度差值Fig.4 Difference of pad thickness of hind paw in mice after DTH experiment

    如上圖所示,高壓組、凍融組與對照組之間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。與對照組比較,各實(shí)驗(yàn)組DTH 反應(yīng)明顯升高(P<0.05),但有文獻(xiàn)表明:成瘤后隨著腫瘤的增大,DTH 反應(yīng)呈下降趨勢[8]。

    2.5 小鼠體內(nèi)熒光成像 尾靜脈注射腫瘤1 周后小鼠體內(nèi)并未檢測到明顯的熒光成像(圖5),表明此時(shí)小鼠體內(nèi)并未形成明顯轉(zhuǎn)移瘤,或者形成轉(zhuǎn)移瘤但體積小熒光弱,被體表皮毛覆蓋。注射腫瘤2周后可檢測到熒光(圖6、7)。由圖6 可見,凍融組比高壓組熒光強(qiáng)度高、面積大,可見體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤生長較為旺盛。而高壓組比對照組熒光強(qiáng)度低、面積小,可見腫瘤生長受到限制(圖7)。

    圖5 小鼠體內(nèi)熒光成像照片F(xiàn)ig.5 Photo fluorescence imaging in vivo

    圖6 尾靜脈注射腫瘤2 周后成像圖片F(xiàn)ig.6 Imaging picture of tail vein injection of tumor after two weeks

    圖7 尾靜脈注射腫瘤2 周后成像圖片F(xiàn)ig.7 Imaging picture of tail vein injection of tumor after two weeks

    3 討論

    黑色素瘤疫苗是利用腫瘤細(xì)胞或抗原物質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng),是一種主動(dòng)特異性免疫治療方法[9]。全細(xì)胞破碎研制腫瘤疫苗其優(yōu)勢在于細(xì)胞表面所有潛在的相關(guān)抗原均有可能被加工和提呈,激活多克隆淋巴細(xì)胞,具有激發(fā)免疫反應(yīng)的巨大潛力。

    靜水高壓處理對于細(xì)胞膜的流動(dòng)性、通透性以及細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)都具有明顯的影響甚至破壞作用[10],使腫瘤細(xì)胞隱藏亞單位結(jié)構(gòu)抗原位置暴露出來,增強(qiáng)了免疫原性。而且此方法制備疫苗具有不添加滅活劑、工藝簡單、生產(chǎn)周期短、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。由此可見,靜水高壓應(yīng)用于制備疫苗具有廣闊的發(fā)展前景。凍融法是將細(xì)胞凍結(jié)再融化,如此細(xì)胞膜親水性、通透性增加,細(xì)胞內(nèi)冰晶使細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生滲透壓,并且胞內(nèi)形成的冰晶也會(huì)破壞細(xì)胞膜[11]。

    腫瘤細(xì)胞表面抗原及胞內(nèi)蛋白經(jīng)高壓處理后,會(huì)使肽鏈的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,暴露相應(yīng)的功能單位及亞單位,增強(qiáng)了瘤苗的抗原性,從而可以有效地激活自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK)的活性,產(chǎn)生IFN-γ、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)等細(xì)胞因子,利于樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell,DC)存活和分化[12]。樹突狀細(xì)胞(DC)是體內(nèi)最高效能的抗原提呈細(xì)胞,在抗腫瘤免疫中處于核心地位[13]。而DC 激活的抗原特異性T 細(xì)胞通過釋放IL-2,又可以激活NK 細(xì)胞,使抗腫瘤的固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答都得到活化和增強(qiáng)[14]。Rosenblatt等[15]認(rèn)為將腫瘤細(xì)胞的全部抗原提呈給樹突狀細(xì)胞,從而激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗腫瘤反應(yīng),為T 淋巴細(xì)胞提呈了腫瘤的全套抗原,從而產(chǎn)生更好的抗腫瘤效果。而反復(fù)凍融可能在改變抗原蛋白空間結(jié)構(gòu)及暴露蛋白質(zhì)亞單位方面不如靜水高壓效果明顯。這可能是兩種疫苗效果差異的主要原因。另外反復(fù)凍融可產(chǎn)生許多細(xì)小冰晶,可能也對抗原蛋白產(chǎn)生了一定的影響。本實(shí)驗(yàn)對靜水高壓在研制黑色素瘤疫苗方面的應(yīng)用進(jìn)行了初步探索,同時(shí)也存在研究上的幾個(gè)限制:小鼠的毛發(fā)、腫瘤表面組織及腫瘤的深度是否會(huì)對熒光成像結(jié)果產(chǎn)生影響,尚待進(jìn)一步研究。腫瘤細(xì)胞在靜水高壓中的破碎方式是十分復(fù)雜的,不同的壓強(qiáng)是否會(huì)產(chǎn)生不同的免疫反應(yīng)。并且全細(xì)胞疫苗中主要誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的成分,本實(shí)驗(yàn)尚未闡明。且全細(xì)胞疫苗注入體內(nèi)是否會(huì)產(chǎn)生全身的遲發(fā)型超敏反應(yīng),尚且有待進(jìn)一步研究。

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