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      遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)中大鼠海馬CA1 區(qū)TLR4 和IL-6 的表達變化及其意義

      2015-03-18 11:41:12常莉莎王大力劉會英華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科二病區(qū)唐山063000
      中國免疫學(xué)雜志 2015年8期
      關(guān)鍵詞:陽性細(xì)胞腦缺血海馬

      張 江 常莉莎 王大力 周 濤 劉會英 (華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科二病區(qū),唐山 063000)

      遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)是指器官缺血后,對遠(yuǎn)隔器官進行短暫的輕度的缺血再通,可起到保護作用[1]。研究表明肢端缺血可以減少海馬CA1 區(qū)的延遲神經(jīng)元損傷[2]。但其機制尚不清楚。ILR4 為人體固有免疫的觸發(fā)因子[3],參與介導(dǎo)對抗病原體的一系列炎癥反應(yīng),誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子IL-6 等的釋放。鑒于上述過程是缺血再灌注損傷的重要機制之一[4],本實驗在此基礎(chǔ)上,探討了遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)的腦保護作用與TLR4 和IL-6 表達的關(guān)系。

      1 材料與方法

      1.1 動物分組及模型制備 72 只健康雄性SD 大鼠[自北京華阜康生物科技股份有限公司購買,實驗動物使用許可證編號:SCXK(京)2009-2004],體重250~300 g,隨機分為假手術(shù)組(S 組)、對照組(C 組)、遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)組(P 組),各組分為12、48、24、72 h 共4 個時間點組,每組6 只大鼠。應(yīng)用改進的Longa[5]法,建立右側(cè)腦缺血再灌注模型。大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后,小心分離右側(cè)頸總動脈和頸外動脈,線栓由頸總動脈進入頸內(nèi)動脈至大腦中動脈,線栓頭端距血管分叉處約18 mm。2 h 后再次麻醉大鼠,C 組直接拔除線栓;P 組在拔除線栓后即刻用止血帶扎緊雙側(cè)后肢根部,扎緊/松開各10 min 循環(huán)3 次,此為RIP。假手術(shù)組只分離出各動脈,不置入線栓。以大鼠麻醉清醒后出現(xiàn)對側(cè)肢體癱瘓為標(biāo)準(zhǔn)。參照Zea Longa[5]的5 分制評分標(biāo)準(zhǔn),剔除評分為0 分和4 分的大鼠,保證各小組6 只不變。

      1.2 HE 染色及免疫組化染色 分別于各時間點將大鼠深度麻醉后,用4%多聚甲醛溶液行心臟灌流,斷頭取腦后行外固定。鼠腦做約2 mm 冠狀切片,常規(guī)石蠟包埋,制成厚約4 μm 的切片,取海馬最大的冠面切片用于HE 染色和免疫組化染色。

      1.2.1 HE 染色 依照常規(guī)方法脫蠟、染色、脫水、透明、封片后,光鏡下觀察。

      1.2.2 免疫組化染色 TLR4 和IL-6 抗體均為兔抗大鼠、小鼠、人多克隆抗體(由北京博奧森生物有限公司),稀釋度均為1∶200;PV6001 試劑盒購自于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。應(yīng)用常規(guī)PV法:脫蠟至去離子水,枸櫞酸修復(fù)緩沖液行抗原高壓熱修復(fù),自然冷卻至室溫,3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶10 min,PBS 緩沖液洗滌3 min ×3 次,滴加特異性抗體,4℃孵育過夜,PBS 緩沖液洗滌3 min×3 次,PV6001 試劑盒中的試劑(抗兔抗體酶復(fù)合物)37℃孵育30 min,再次PBS 緩沖液洗滌3 min×3 次,DAB 鏡檢控制顯色,流水沖洗3 h 以上去除DAB 殘留物,蘇木素復(fù)染,脫水、透明封片。光鏡下觀察。用PBS 代替一抗作陰性對照,以胞漿為棕黃色為陽性。每只大鼠取連續(xù)4 張相同部位的切片,每張切片在200 倍光鏡下隨機取海馬CA1 區(qū)的6 個不同視野,通過Motic Med 6.0 數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)統(tǒng)計每個視野的免疫組化陽性細(xì)胞數(shù),取其平均數(shù)為該大鼠陽性細(xì)胞的表達數(shù)量。

      1.2.3 Western blot 法檢測 TLR4 蛋白取腦組織標(biāo)本與RIPA(用前加入PMSF 至終濃度為1 mol/L)組織裂解液按約1∶3的比例混合搗碎冰上裂解40 min,40℃離心15 min,取上清-20℃保存。BCA 蛋白濃度測定。

      圖1 三組大鼠海馬CA1 區(qū)HE 染色結(jié)果(×200)Fig.1 Three groups of CA1 region of hippocampus in rats with HE staining(×200)

      1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行分析,計量資料用±s 表示,采用單因素方差分析,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 各組大鼠海馬CA1 區(qū)HE 染色結(jié)果 S 組大鼠海馬結(jié)構(gòu)清晰,CA1 區(qū)細(xì)胞形態(tài)正常,排列整齊,胞質(zhì)染色均勻,胞核顏色正常,圓形或橢圓形,核仁明顯,核膜清晰(圖1A)。C 組大鼠海馬結(jié)構(gòu)松散,CA1 區(qū)細(xì)胞稀疏,神經(jīng)元明顯減少,可見較多的神經(jīng)元胞體縮小,胞漿濃縮深染,胞核固縮,核仁核膜消失;也有的神經(jīng)元腫脹淡染,呈三角形或者梭形;有的胞漿出現(xiàn)大片空泡區(qū),提示腦水腫嚴(yán)重;有些區(qū)域出現(xiàn)小片壞死,細(xì)胞核碎裂甚至溶解消失(圖1B)。P 組大鼠海馬結(jié)構(gòu)欠完整,但較C 組神經(jīng)元缺失減少,胞體縮小深染現(xiàn)象明顯改善,神經(jīng)元腫脹減輕(圖1C)。

      2.2 各組大鼠海馬CA1 區(qū)免疫組化染色結(jié)果

      2.2.1 TLR4 染色結(jié)果 在海馬CA1 區(qū),S 組各時間點TLR4 表達水平均低。C 組與P 組TLR4 表達較S 組明顯增高(P<0.05)。在C 組,TLR4 12 h 開始表達,24 h 達到高峰,72 h 開始下降。P 組TLR4陽性表達在72 h 前均低于C 組(P<0.05),而72 h時略高于C 組,但無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05)。實驗結(jié)果提示缺血再灌注時,大鼠海馬CA1 區(qū)TLR4 被激活,但遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)使TLR4 的激活受到抑制而延遲。見表1,圖2。

      表1 各組大鼠海馬CA1 區(qū)TLR4 陽性細(xì)胞表達數(shù)比較(±s)Tab.1 Comparison of number of positive expression of TLR4 in hippocampus CA1 region of each group(±s)

      表1 各組大鼠海馬CA1 區(qū)TLR4 陽性細(xì)胞表達數(shù)比較(±s)Tab.1 Comparison of number of positive expression of TLR4 in hippocampus CA1 region of each group(±s)

      Note:The observation time n=6;Compared with the sham group,1)P<0.05;Compared with the control group,2)P<0.05.

      圖2 三組大鼠海馬CA1 區(qū)TLR4 表達結(jié)果(×200)Fig.2 Result of TLR4 expression in three group of rat hippocampal CA1 region(×200)

      表2 各組大鼠海馬CA1 區(qū)IL-6 陽性細(xì)胞表達數(shù)比較(±s)Tab.2 Comparison of number of positive expression of IL-6 in hippocampus CA1 region of each group(±s)

      表2 各組大鼠海馬CA1 區(qū)IL-6 陽性細(xì)胞表達數(shù)比較(±s)Tab.2 Comparison of number of positive expression of IL-6 in hippocampus CA1 region of each group(±s)

      Note:The observation time n=6;Compared with sham group,1)P<0.05;Compared with the control group,2)P<0.05.

      表3 I/R 組和RPC 組大鼠海馬區(qū)TLR4 蛋白表達的相對吸光度比較(n=6,±s)Tab.3 Comparison of relative absorbance of group I/R and group RPC in hippocampus of the rat TLR4 protein expression(n=6,±s)

      表3 I/R 組和RPC 組大鼠海馬區(qū)TLR4 蛋白表達的相對吸光度比較(n=6,±s)Tab.3 Comparison of relative absorbance of group I/R and group RPC in hippocampus of the rat TLR4 protein expression(n=6,±s)

      Note:Compared with the control group,1)P<0.05.

      2.2.2 IL-6 染色結(jié)果 在海馬CA1 區(qū),S 組各時間點IL-6 僅有少量表達。C 組與P 組有明顯的IL-6 表達,與S 組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。IL-6 在C 組12 h 開始表達,48 h 達到高峰,72 h 開始下降。P 組IL-6 陽性細(xì)胞表達在各時間點均低于C 組,有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。實驗結(jié)果提示缺血再灌注時,大鼠海馬CA1 區(qū)的IL-6 被激活,但遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)使IL-6 的激活受到抑制。見件表2,圖3、4。

      2.2.3 Western blot 定量檢測TLR4 表達結(jié)果Western blot 掃描圖片結(jié)果顯示:I/R 組和RPC 組TLR4 蛋白表達各時間點較Sham 組明顯增強。均在24 h 達高峰,48 h 后呈下降趨勢。RPC 組各時間點TLR4 蛋白表達較I/R 組減少,比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

      3 討論

      缺血再灌注所致的腦損傷,已被證明是影響關(guān)于血管再生預(yù)后的重要因素[6],許多研究者都致力于尋找新的藥物和方法來保護腦組織免受缺血再灌注損傷。早在50 多年前,Sewell[7]及其同事就曾報道,間歇的再灌注(相當(dāng)于目前的缺血后處理),可以廢除心室顫動。直到2003 年Zhao 等[8]人提出“缺血后適應(yīng)”這一假說后,缺血后適應(yīng)的概念引起越來越多的重視。而如今,經(jīng)典的缺血后適應(yīng)已經(jīng)延伸包括藥理學(xué)后適應(yīng)和遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)。最早發(fā)現(xiàn)可以實施遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)的器官為腎臟,由Kerendi 等[2]通過短暫夾閉小鼠腎動脈而實現(xiàn)對小鼠缺血心肌的保護作用。接著肢體遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)的心肌保護作用也得到證實[9]。在腦缺血的研究中,也已有研究提示肢體的缺血后適應(yīng)具有神經(jīng)保護作用[10]。

      圖4 各組不同時間點海馬TLR4 免疫印跡Fig.4 Each group at different time points in hippocampal TLR4 blotting

      對于遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)的機制少有報道,目前普遍認(rèn)為遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)的腦保護作用在于通過肢端、腎臟等短暫的缺血再灌注使心臟或腦產(chǎn)生對隨后而來的較嚴(yán)重缺血再灌注損傷的耐受能力,而缺血再灌注損傷的重要機制之一為免疫炎癥反應(yīng),TLR4 則是免疫炎癥反應(yīng)的重要環(huán)節(jié),內(nèi)源性配體與TLR4 結(jié)合后發(fā)生結(jié)構(gòu)改變,并募集髓樣分化蛋白88(Myeloid differentiation protein 88,MyD88)等轉(zhuǎn)接蛋白,通過MyD88 依賴或非依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 和干擾素相關(guān)蛋白(Interferon binding protein,IRFs),進而誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α,IL-1 和IFN-γ 等一系列炎癥細(xì)胞因子[11]。已有實驗證明,在樹鼩血栓性腦缺血的模型中,缺血后適應(yīng)4 h 及24 hTLR4 蛋白表達減少,提示缺血后適應(yīng)可能與調(diào)控TLR4 表達有關(guān)[12]。

      本研究實驗結(jié)果顯示,大鼠腦缺血再灌注后12 h時TLR4 和IL-6 的表達已經(jīng)開始增高,提示缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)在12 h 已經(jīng)啟動,TLR4 和IL-6 表達分別于24、48 h 達到高峰,與對照組相比,遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)組TLR4 表達在12、24、48 h 均受抑制,提示遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)的腦保護作用與抑制TLR4表達有關(guān),而在72 h 表達水平與對照組相當(dāng),可能與腦缺血后期腦組織的自身修復(fù)有關(guān)。IL-6 在遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)中的表達于各時間點都低于對照組,提示其激活在遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)中受到抑制。

      通過本實驗可以推斷遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)可以通過抑制TLR4、IL-6 相關(guān)的炎癥反應(yīng)實現(xiàn)腦保護作用,為進一步明確遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)的分子機制以及臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。

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