鼠傷寒沙門菌SL1344 株sipB 和crp 基因缺失對其侵襲力影響的比較①

陳松彪 張春杰 程相朝 李銀聚 李 靜 何 雷 郁 川 張明亮 余祖華 賈艷艷 趙戰(zhàn)勤

(河南省動物疫病與公共安全院士工作站/河南科技大學動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室，洛陽 471003)

鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)是一群非適應性或泛嗜性的沙門菌，具有廣泛的宿主，是目前世界各國分離率最高的菌型之一。該菌能引起各種哺乳動物以及人類發(fā)生全身性感染，具有重要的公共衛(wèi)生意義［1］。

沙門菌的致病機制主要與Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)有關，由SPI-1 和SPI-2 兩個毒力島編碼，毒力島(Pathogenicity island)是存在于病原菌染色體上的特定區(qū)域，編碼與毒力相關的基因，負責細菌效應蛋白的分泌和轉運，通過改變宿主細胞的生理機能來促進細菌的侵入與存活。因此，T3SS 所分泌的蛋白在利用宿主細胞促進細菌侵入，誘導炎癥反應，以及創(chuàng)造胞內生小境來促進細菌在細胞內的存活和復制等方面發(fā)揮著重要作用［2］。

沙門菌入侵蛋白是侵入過程的起始中心，sipB是編碼沙門菌轉運蛋白的其中一個基因，已有研究表明SipB 可以調節(jié)Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TTSS)調節(jié)蛋白的傳遞［3］。越來越多的證據(jù)表明位于毒力島1(SPI-1)上的SipB 效應蛋白主要通過天冬氨酸特異性蛋白酶1(caspase-1)激活IL-1b 和IL-18 促進宿主細胞的壞死和凋亡［4，5］。最近的研究發(fā)現(xiàn)SipB 蛋白能夠插入到宿主的細胞膜中形成一個離子通道，從而能夠改變效應蛋白在宿主細胞中的位置［6］，SipB 蛋白在維持細菌細胞膜完整性和耐高滲性方面扮演著重要的角色［7］。而crp 基因編碼腺苷酸環(huán)化酶受體蛋白，其突變株能在普通培養(yǎng)基上生長，消除了細菌在哺乳動物中攝取cAMP 的唯一途徑，其作為沙門菌重要的毒力基因，國內外學者一直在不斷地研究［8，9］。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)crp 和sipB缺失株均能夠顯著降低對哺乳動物的毒力［10，11］，但是這種毒力的降低是由什么機制引起的目前尚少見有關報道，因此本實驗在實驗室前期研究的基礎上對crp 和sipB 缺失株的其他生物學特性進一步的研究，以小鼠和細胞建立感染模型，分別對兩種缺失株進行體內和體外的侵襲力試驗，為crp 和sipB 缺失株的減毒機制研究奠定了實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞和培養(yǎng)條件 鼠傷寒沙門菌SL1344 強毒株由南京農(nóng)業(yè)大學惠贈;SL1344Δ sipB、SL1344Δ crp、HeLa 細胞由河南科技大學動物疫病與公共衛(wèi)生實驗室構建并保存;鼠傷寒沙門菌在37℃靜止或振搖培養(yǎng);細胞在37℃和5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2 主要試劑、培養(yǎng)基和實驗動物 生化鑒定試劑由杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn);沙門菌屬診斷血清(11 種)及各種單因子血清由寧波天潤生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn);DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Sigma 公司;Triton X-100 購自Sangon 公司。麥康凱瓊脂和SS 瓊脂培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;胰蛋白胨、酵母浸出物等由英國OXOID 公司生產(chǎn);6 周齡的BALB/c 小鼠購自鄭州大學實驗動物中心［SCXK(豫)2010-0002］。

1.3 Δcrp 和ΔsipB 缺失株的表型鑒定 將缺失株利用玻片凝集試驗進行血清型鑒定，同時將兩株缺失株與SL1344 分別接種于含1%麥芽糖的麥康凱固體培養(yǎng)基上，研究菌落生長狀況;然后挑單菌落轉接含葡萄糖、蔗糖、鼠李糖、甘露醇、麥芽糖糖等生化鑒定管，研究其生化特性。

1.4 Δcrp 和ΔsipB 缺失株的生長特性鑒定 將兩株缺失株與親本株SL1344 在LB 中37℃培養(yǎng)過夜，無菌生理鹽水連續(xù)10 倍稀釋，取100 μl 適當稀釋度菌液均勻涂布于LB 固體平板上，每個稀釋度做3個重復，37℃培養(yǎng)過夜，計數(shù)，取平均值計算原液的CFU。然后以終濃度約為106CFU/ml 轉接于相同液體培養(yǎng)基，37℃、200 r/min 培養(yǎng)，每1 h 取樣并進行涂板計數(shù)，繪制生長曲線。

1.5 Δcrp 和ΔsipB 缺失株感染小鼠后在體內動態(tài)分布 6 周齡BALB/c 小鼠(16 只/每組)口服crp、sipB 缺失株1 ×107CFU，每周每組解剖4 只，共3組，并且取其肝、脾研磨進行稀釋計數(shù)，連續(xù)測定4周，并設親本菌株對照組。

1.6 Δcrp 和ΔsipB 缺失株感染上皮細胞黏附試驗感染前16 h 將細胞按照按每孔1 ×105細胞接種于24 孔板;將細菌調至OD600=0.4，用無抗生素的DMEM 培養(yǎng)基洗3 次，按100∶1 的細菌/細胞比例調整細菌濃度，加入1 ml/孔至細胞培養(yǎng)板，900 r/min離心10 min，37℃5%CO2作用2 h;PBS 洗3 次，加入300 μl 的胰酶作用5 min，再加入700 μl 5%BSAPBS 吹勻，稀釋涂板，培養(yǎng)24 h 后計數(shù)，以黏附的細菌數(shù)/接種細菌數(shù)計算黏附率。每次試驗重復2 孔，每個試驗重復3 次。

1.7 Δcrp 和ΔsipB 缺失株感染上皮細胞侵入試驗 參照Dong［12］的方法將細胞按照每孔1 ×106細胞接種于6 孔板;將細菌調至OD600=0.4，用無抗生素的DMEM 培養(yǎng)基洗三次，按100∶1的細菌/細胞比例調整細菌濃度，加入1 ml/孔至細胞培養(yǎng)板，900 r/min 離心10 min，37℃5%CO2作用2 h;PBS 洗3 次，在PBS 洗3 次后，換含100 μg/ml 慶大霉素的DMEM 作用90 min;PBS 洗3 次，再加入1 ml 含0.1% Triton X-100 的PBS，吹勻，PBS 稀釋涂板，培養(yǎng)24 h 后計數(shù)，以侵入的細菌數(shù)/接種細菌數(shù)計算侵入率。每次試驗重復2 孔，每個試驗重復3 次。

1.8 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)分析用SPSS13.0 軟件進行，各組間差異比較采用t 檢驗，P＜0.05 或P＜0.01 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Δcrp 和ΔsipB 缺失株的表型鑒定 親本菌株SL1344 和SL1344ΔsipB 在含1%麥芽糖的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈紅色菌落，可利用麥芽糖，而SL1344Δcrp 不能利用麥芽糖，在含1%麥芽糖的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈無色菌落(見圖1)。生化試驗結果表明，SL1344ΔsipB 利用碳源的能力與SL1344基本相同，但SL1344Δcrp 與親本菌株相比，只保留了利用葡萄糖的能力，不能夠利用半乳糖、麥芽糖、木糖、鼠李糖、山梨醇、甘露醇(表1)。

2.2 Δcrp 和ΔsipB 缺失株生長特性鑒定 將缺失株SL1344Δcrp、SL1344ΔsipB 及親本株SL1344 菌液濃度均調整至1 ×106CFU/ml 為起始濃度開始振蕩培養(yǎng)，每隔1 h 取樣進行涂板計數(shù)，結果顯示，SL1344ΔsipB 和親本菌株SL1344 生長速度沒有明顯差異，而SL1344Δcrp 較親本菌株相比發(fā)生了顯著的降低(圖2)。

2.3 Δcrp 和ΔsipB 缺失株免疫小鼠后在體內的動態(tài)分布 基因缺失株實驗組和親本株對照組的小鼠均口服免疫1 ×107CFU 劑量的菌液，親本株在肝、脾內的細菌數(shù)顯著高于各缺失株，并于1 周內全部死亡。其中crp 基因缺失組在各臟器分離到的細菌數(shù)目高于sipB 缺失組，兩組實驗組的細菌均是在肝中逐漸被清除，到第4 周被基本清除;在脾臟中的細菌到接種后第4 周仍保持低水平的細菌數(shù)(見表2)。

2.4 Δcrp 和ΔsipB 缺失株感染上皮細胞黏附和侵入試驗 由圖3 可知，當HeLa 細胞細胞形成單層后，以100MOI 的量接種親本株或缺失株細菌，黏附試驗表明，sipB 基因缺失組的黏附率(圖3A)和侵入率(圖3B)顯著低于對照組，而crp 基因實驗組與對照組無明顯差異。

圖1 SL1344、SL1344ΔsipB 和SL1344Δcrp 在培養(yǎng)基上的生長情況Fig.1 Growth of SL1344，SL1344ΔsipB and SL1344-Δcrp on medium

圖2 缺失菌株SL1344ΔsipB、SL1344Δcrp 與親本菌株SL1344 的CFU 生長曲線Fig.2 Growth curves of SL1344ΔsipB，SL1344Δcrp and SL1344 base on CFU

圖3 SL1344△sipB、SL1344△crp 和SL1344 對HeLa 細胞的黏附率和侵入率試驗Fig.3 Adherence and intracellular assay of SL1344，SL1344△sipB and SL1344△crp to HeLa cells

表1 SL1344，SL1344Δcrp 和SL1344ΔsipB 生化特性比較Tab.1 Comparison of biochemical characteristics of SL1344，SL1344Δcrp and SL1344ΔsipB

表2 免疫后4 周內細菌在BALB/c 小鼠體內的分布Tab.2 Distribution of bacteria in BALB/c mice on 4 weeks post-inoculation

3 討論

鼠傷寒沙門菌具有非連續(xù)的侵入非吞噬細胞的能力，細菌的效應蛋白穿過宿主細胞的細胞膜主要由一些轉運蛋白參與完成的，這些轉運蛋白包括SipB、SipC、SipD，這些轉運蛋白可能形成一個通道使細菌的一些效應蛋白通過細胞膜［13］。在沙門菌感染紅細胞過程中需要上述三個轉運蛋白形成一個功能性小孔，它們在沙門菌侵染哺乳動物細胞過程中扮演著非常重要的角色［14］。其中SipB 是SPI-1 T3SS 的效應蛋白，與細菌侵入有關。Santos 等［15］報道在鼠傷寒沙門菌感染牛巨噬細胞早期sipB 缺失株能夠顯著降低巨噬細胞發(fā)生凋亡。我們在研究過程中也發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門菌SL1344 株sipB 的基因缺失株能夠降低對小鼠的致病性，但機制尚不清楚，因此本實驗對構建的缺失株進行了后續(xù)研究。有學者研究發(fā)現(xiàn)，和sipB 同樣位于SPI-1 上的編碼腺苷酸環(huán)化酶受體蛋白crp 基因缺失株通過消除消除了細菌在哺乳動物中攝取cAMP 的唯一途徑，影響參與碳水化合物、氨基酸和小肽代謝的廣泛功能及影響菌毛與鞭毛的表達和降低其生長增殖速度等途徑來降低其毒力［16，17］。我們的研究結果發(fā)現(xiàn)crp 基因缺失株失去了利用麥芽糖、半乳糖、山梨醇等的能力，并且生長速度與親本菌株相比也發(fā)生了顯著的下降，兩者的結論相一致。而sipB 基因缺失株仍然保持著利用麥芽糖、半乳糖、山梨醇等的能力，并且其生長速度較親本菌株相比沒有發(fā)生明顯的變化，說明sipB 基因缺失后不影響菌株參與碳水化合物、氨基酸和小肽代謝等功能。通過構建小鼠感染模型和上皮細胞感染模型對缺失株進行侵襲力比較。在小鼠體內的動態(tài)分布結果表明缺失菌株較親本菌株相比在肝臟和脾臟分離到的細菌數(shù)明顯的低于親本菌株，并且均能很快地被清除，實驗組間對比發(fā)現(xiàn)sipB缺失組在各臟器分離到的細菌數(shù)低于crp 缺失組，說明sipB 基因缺失實驗組對小鼠內臟器官的毒力和侵襲力下降更明顯，細胞的黏附和侵入試驗結果顯示缺失sipB 基因后能夠顯著降低對上皮細胞的黏附和侵入能力，而crp 基因缺失株實驗組與親本菌株對照組無明顯差別，均與前面的小鼠試驗模型結果相一致。通過以上試驗結果說明sipB 基因缺失株可能是通過降低對機體的內臟器官和上皮細胞的黏附和入侵能力來達到降低毒力的目的，而crp基因缺失株可能通過影響參與碳水化合物、氨基酸和小肽代謝的廣泛功能及影響菌毛與鞭毛的表達和降低其生長增殖速度等途徑來降低其毒力。

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