沉默GRP94 表達(dá)對(duì)肺癌A549 細(xì)胞增殖能力的影響①

鄧 雨 杜 銘 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸心外科，重慶 400016)

肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一，其中其發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快［1］。非小細(xì)胞肺癌占總量的80%，由于缺乏有效的早期診斷及綜合治療，其5 年生存率很低［2］。而癌細(xì)胞的惡性增殖是治療肺癌患者的一大難題原因，因此對(duì)肺癌細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用的因子的研究對(duì)于肺癌的治療及預(yù)后具有重要意義。

通過(guò)化學(xué)合成siRNA 特異性下調(diào)靶基因的表達(dá)，而進(jìn)行的分子靶向治療是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)［3］，GRP94 基因是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的豐度蛋白之一，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶參與了蛋白質(zhì)的合成與降解。研究表明GRP94 在乳腺癌、胰腺癌及肺癌等多種腫瘤中呈高表達(dá)趨勢(shì)，且與腫瘤化療藥物的耐藥性密切相關(guān)［4-7］。本研究在mRNA 及蛋白水平分別檢測(cè)了分子伴侶GRP94 在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，進(jìn)一步針對(duì)GRP94 基因化學(xué)合成小干擾RNA，研究其對(duì)人肺腺癌A549 增殖能力的影響極其可能機(jī)制，為探討GRP94 在肺癌增殖過(guò)程中的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco 公司;兔抗人cyclinD1 單克隆抗體購(gòu)自CST公司;兔抗人c-myc 單克隆抗體購(gòu)自Bioworld 公司;兔抗人GRP94 單克隆抗體購(gòu)自Abcam 公司;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000 購(gòu)自Invitrogen 公司;Total RNA 提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA 公司;蛋白提取試劑盒和ECL 發(fā)光試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 siRNA 的合成 根據(jù)GRP94 基因在Genebank中的序列(NO:NM-003299.2)設(shè)計(jì)靶向Grp94 基因的siRNA 序 列(UACUGUACCAUCCACAUCA)，siRNAnegative control 序列，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，干粉siRNA 用DEPC 水稀釋成20 μmol/L，-20℃保存。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人肺癌細(xì)胞(A549、H1299、H226、H460)及肺支氣管上皮細(xì)胞(BEP-2D，HBE)由重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心保存。經(jīng)復(fù)蘇后于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，A549 細(xì)胞轉(zhuǎn)染前24 h，以2 ×105個(gè)/孔細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)，參照Lipofectamine2000產(chǎn)品說(shuō)明書，分別將siRNA-NC 和siRNA-GRP94 轉(zhuǎn)染至六孔培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染6 h 后更換新鮮培養(yǎng)基。

1.4 qRT-PCR 法 收集轉(zhuǎn)染48 h 后各組細(xì)胞，按照Total RNA 提取試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA。采用SYBR Green 法進(jìn)行qRT-PCR，用于擴(kuò)增GRP94 cDNA 的上游引物:5'-GGGAGGTCACCTTCAAGTCG-3'。下游引物:5'-GGGTGTAGACGTGGAGCTC-3';β-actin 上游引物:5'-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3'，下游引物:5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，反應(yīng)條件為:95℃3 min;95℃5 s，60℃15 s，72℃15 s，共39 個(gè)循環(huán);同一實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT法計(jì)算。

1.5 Western blot 法 分別收集轉(zhuǎn)染72 h 后各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。加入5 × SDS 上樣緩沖液100℃，變性5 min;每孔40 μg，80V 恒壓SDS-Page 電泳，250 mA恒流2 h 冰浴，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗GRP94(1∶1 000)，β-actin (1∶3 000)，c-myc (1∶500)，cyclinD1 (1∶1 000)4℃過(guò)夜，次日TBST 漂洗5 min ×5 次，加入HRP 標(biāo)記的二抗(羊抗兔1 ∶4 000)室溫孵育1 h，TBST 漂洗10 min×3 次，ECL 化學(xué)發(fā)光顯影。

1.6 CCK-8 測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖曲線 將轉(zhuǎn)染24 h 后的各組細(xì)胞消化收集，計(jì)數(shù)，以每孔3 000 個(gè)/100 μl 接種于96 孔板中，待細(xì)胞貼壁后記為1 d 分別在1、2、3、4、5 d 時(shí)間點(diǎn)分別加入10 μl 的CCK-8溶液，37 度孵育1.5 h 后在波長(zhǎng)450 nm 處檢測(cè)其光密度值。

1.7 平板集落實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力 收集轉(zhuǎn)染24 h 后的各組細(xì)胞，計(jì)數(shù)，以每孔1 000 個(gè)/2 ml 接種于6 孔培養(yǎng)板中，2～3 d 換液，10 d 后取出，PBS 漂洗3 次，加入預(yù)冷分甲醇室溫固定30 min后，0.1%結(jié)晶紫染色。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s 表示，配對(duì)組間采用t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR、Western blot 分別檢測(cè)細(xì)胞在肺癌細(xì)胞系及肺支氣管上皮細(xì)胞系中的表達(dá) 結(jié)果顯示:人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299、H460、H226 中GRP94 mRNA 及蛋白表達(dá)水平明顯高于肺支氣管上皮細(xì)胞系HBE、BEP-2D，尤其GRP94 在A549 細(xì)胞中表達(dá)最高(P ＜0.05，P ＜0.01)。見圖1、2。

圖1 qRT-PCR 檢測(cè)不同肺癌細(xì)胞及肺支氣管上皮細(xì)胞中GRP94 mRNA 的表達(dá)水平Fig.1 Expression of GRP94 mRNA detected by qRTPCR in four lung carcinoma cells and two lung bronchial epithelial cells

圖2 Western blot 檢測(cè)不同肺癌細(xì)胞及肺支氣管上皮細(xì)胞中GRP94 蛋白表達(dá)水平Fig.2 Expression of GRP94 protein detected by Western blot in four lung carcinoma cells and two lung bronchial epithelial cells

2.2 Real-time PCR、Western blot 分別在mRNA和蛋白水平驗(yàn)證GRP94siRNA 沉默效果 結(jié)果顯示:siRNA-NC 組中GRP94 基因的相對(duì)表達(dá)量明顯高于siRNA-GRP94 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，見圖3、4，說(shuō)明GRP94 基因被有效沉默。

2.3 沉默GRP94 對(duì)A549 細(xì)胞增殖能力的影響通過(guò)CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞貼壁后1、2、3、4、5 d的光密度值，繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示，與siRNANC 相比，siRNA-GRP94 組中細(xì)胞生長(zhǎng)速率明顯下降，說(shuō)明沉默GRP94 對(duì)A549 細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖5。

2.4 沉默GRP94 對(duì)A549 細(xì)胞克隆形成能力的影響 平板集落實(shí)驗(yàn)顯示，與siRNA-NC 組相比，siRNA-GRP94 組細(xì)胞克隆數(shù)明顯下調(diào)，說(shuō)明沉默GRP94 抑制了A549 細(xì)胞的克隆形成能力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖6。

2.5 沉 默GRP94對(duì)肺癌A549細(xì)胞c-myc、cyclinD1 表達(dá)的影響 Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA-GRP94 組c-myc、cyclinD1蛋白表達(dá)水平明顯低于siRNA-NC 組(圖7)，說(shuō)明沉默GRP94基因表達(dá)的同時(shí)能抑制c-myc 和cyclinD1 的表達(dá)。

圖3 Real-time PCR 檢測(cè)GRP94mRNA 表達(dá)水平Fig.3 Expression of GRP94 mRNA detected by Real-time PCR

圖4 Western blot 檢測(cè)GRP94 蛋白表達(dá)水平Fig.4 Expression of GRP94 protein detected by Western blot

圖5 CCK-8 測(cè)定沉默GRP94 基因表達(dá)對(duì)A549 胞的生長(zhǎng)影響Fig.5 A549 cells were transfected with NC or GRP94 siRNA and cell growth was evaluated by CCK-8 assay

圖6 平板集落實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默GRP94 對(duì)A549 細(xì)胞克隆形成能力的影響Fig.6 Clonogenic capacity of silencing GRP94 expression in A549 cells were detected by colony formation assay

圖7 沉默GRP94 對(duì)cyclinD1、c-myc 蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Expression of cyclinD1 and c-myc protein detected by Western blot

3 討論

GRP94 基因是HSP90 家族成員之一，調(diào)節(jié)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8，9］。研究發(fā)現(xiàn)，GRP94 的表達(dá)水平與多種腫瘤的細(xì)胞分化程度呈負(fù)相關(guān)，與臨床分期呈正相關(guān)趨勢(shì)［10，11］。姚元春等［12］的研究表明在人胃癌組織中GRP94 的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，且隨著腫瘤的大小表達(dá)發(fā)生變化，腫瘤體積越大，表達(dá)越強(qiáng)，提示我們分子伴侶GRP94 參與了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程，而GRP94 在肺癌細(xì)胞中的研究鮮為人知。本研究檢測(cè)了GRP94 在肺癌細(xì)胞及肺支氣管上皮細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GRP94 在肺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，且在A549 細(xì)胞中表達(dá)最高。同時(shí)采用RNAI 技術(shù)特異性下調(diào)GRP94 表達(dá)，觀察在肺癌A549 細(xì)胞株的增殖能力的變化，結(jié)果顯示，敲降GRP94 基因后，A549細(xì)胞增殖能力明顯下降，克隆形成能力明顯降低，說(shuō)明高表達(dá)GRP94 與肺癌的惡性增殖緊密相關(guān)。而沉默GRP94 表達(dá)后，c-myc、cyclinD1 表達(dá)明顯受到下調(diào)，提示GRP94 可能通過(guò)影響其表達(dá)參與調(diào)控肺癌的增殖能力。

GRP94 可能通過(guò)不同的途徑調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，Tramentozzi 等［13］研究發(fā)現(xiàn)GRP94 依賴PI3K/AKT 信號(hào)通路的活化來(lái)促進(jìn)血管生成。有資料表明，GRP94 可能靶向LRP6 膜蛋白活化wnt/β-catenin 信號(hào)通路參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［14，15］，提示我們?cè)诜伟┲懈弑磉_(dá)的GRP94 可能通過(guò)激活wnt/β-catenin、PI3K/AKT 信號(hào)通路協(xié)同調(diào)節(jié)下游cyclinD1、c-myc 等關(guān)鍵分子的表達(dá)來(lái)促進(jìn)肺癌的增殖能力，進(jìn)而影響肺癌的發(fā)生發(fā)展。此外，本研究為體外實(shí)驗(yàn)，GRP94 基因?qū)υ隗w內(nèi)肺癌的作用仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，肺癌中高表達(dá)的GRP94 參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展，通過(guò)檢測(cè)GRP94 的表達(dá)量將可能作為腫瘤生物學(xué)行為的生物指標(biāo)。隨著對(duì)GRP94 基因功能研究的完善，其必將成為診斷和預(yù)測(cè)肺癌的分子標(biāo)志物和抗肺癌增殖的生物治療靶點(diǎn)。

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