CCR3 在哮喘小鼠氣道組織Muc5ac 表達(dá)中的作用①

王 濤 張建勇 王秀丹 鄭飛彥 楊紅霞 (遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸二科，遵義 563000)

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘)屬于多發(fā)病、常見(jiàn)病，對(duì)人們的身體健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。哮喘氣道炎癥特征主要表現(xiàn)為浸潤(rùn)與活化嗜酸性粒細(xì)胞、活化炎癥細(xì)胞、釋放炎癥介質(zhì)及杯狀細(xì)胞增生。這樣則可分泌大量氣道黏液。當(dāng)氣道炎癥與氣道黏液相互作用時(shí)，則哮喘患者的病情變得更加嚴(yán)重。因此在評(píng)價(jià)哮喘病情嚴(yán)重程度或估計(jì)其預(yù)后的危險(xiǎn)因素時(shí)，應(yīng)重點(diǎn)考慮氣道黏液的高分泌。CCR3 是一種受體蛋白，可產(chǎn)生細(xì)胞遷移、活化效應(yīng)，還可促進(jìn)某些趨化因子反應(yīng)。CCR3 主要存在于嗜酸性粒細(xì)胞中，當(dāng)其與eotaxin-1、eotaxin-2、RANTES、MCP 等，經(jīng)趨化作用刺激炎癥細(xì)胞向氣道黏膜遷移，使氣道黏膜內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。進(jìn)而誘導(dǎo)氣道炎癥的發(fā)生、發(fā)展，加劇哮喘病情［1］。本研究旨在通過(guò)應(yīng)用CCR3 拮抗劑SB328437 干預(yù)哮喘組小鼠，探討CCR3 在哮喘小鼠氣道Muc5ac 表達(dá)中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 50 只6～8 周清潔級(jí)BALB/c 雄性小鼠，體重(18 ±2)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［合格證號(hào)為:SCXK(滬)2009-0005］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑 卵清白蛋白OVA，V 級(jí)及氫氧化鋁凝膠(美國(guó)Sigma 公司)，小鼠抗小鼠-Muc5ac單克隆抗體(美國(guó)Neomarkers 公司)，小鼠IL-4 ELISA 試劑盒及小鼠TNF-α ELISA 試劑(武漢博士德生物工程有限公司)，DAB 顯色試劑盒、鼠抗抗體二步法試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司)，SB328437 Lot B38883(美國(guó)MERCK 公司)，兔抗鼠CCR3 多克隆抗體(美國(guó)ABCAM 公司)，RNAiso Reagent 試劑(美國(guó)Invitrogen 公司)，熒光定量RTPCR 兩步法試劑盒及熒光定量RT-PCR 引物(CCR3、Muc5ac、β-actin)均有大連TaKaRa 公司設(shè)計(jì)、生產(chǎn)，Icycler iQ5 熒光定量PCR 儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2.2 制備小鼠哮喘模型分組及藥物干預(yù) (1)分組:50 只小鼠經(jīng)隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為5 組，分別為正常對(duì)照組(NS 組)、哮喘組(AS 組)、地塞米松干預(yù)組(AS +DEX 組)、SB328437 干預(yù)組(AS +SB組)及溶劑對(duì)照組二甲基亞砜組(AS+DMSO 組)，各10 只。第0 天與第10 天在其腹腔中注射0.2 ml致敏液(100 μg OVA 及2.5 mg 氫氧化鋁凝膠);第14 天經(jīng)1%OVA 溶液行超聲霧化，30 min/次，連續(xù)7 d。正常對(duì)照組經(jīng)生理鹽水行致敏與霧化。(2)干預(yù)方法:地塞米松干預(yù)組、地塞米松干預(yù)組及溶劑對(duì)照組于OVA 霧化激發(fā)前1 h 分別腹腔注射SB328437(5 mg/kg)、地塞米松(2 mg/kg)及二甲基亞砜0.1 ml，1 次/d，連續(xù)7 d。小鼠于末次激發(fā)后12 h，行麻醉處死，結(jié)扎右肺，放入4%多聚甲醛中固定，將右肺上葉放入凍存管內(nèi)，在-150℃凍存。后將頸部器官暴露出，在氣管下段做“T”形切口，插入22G 留置針行氣管插管，將0.3 ml 生理鹽水緩慢注入，反復(fù)回抽3 次，經(jīng)3 次灌洗(回收率＞80%)，為支氣管肺泡灌洗液(BALF)。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法 制備肺組織的切片，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.1 AB-PAS 染色 切片脫蠟至水，后浸入阿爾辛藍(lán)染液10 min，水洗5 min，1 次蒸餾水洗，浸入1%高點(diǎn)酸液10 min，水洗5min，浸入雪夫氏試劑5 min，沖洗5 min，脫水至無(wú)水酒精，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.3.2 BALF 細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi) 在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù);同時(shí)將BALF 離心，將沉淀細(xì)胞行涂片，經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色，計(jì)算各種細(xì)胞的百分比。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)氣道Muc5ac 及CCR3 表達(dá) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)SP 法免疫組，一抗為小鼠抗Muc5ac 單克隆抗體，兔抗為小鼠CCR3 多克隆抗體，稀釋濃度均為1∶100，熒光定量RT-PCR 檢測(cè)小鼠肺組織 Muc5ac mRNA、CCR3mRNA 的表達(dá)，熒光定量PCR 反應(yīng)(SYBR Green Ⅰ嵌合熒光法)，PCR 引物的設(shè)計(jì)和合成，小鼠CCR3 引物及內(nèi)參照β-actin 引物的設(shè)計(jì)和合成，其序列如下:CCR3 引物序列:上游5'-GGCACTATGCAAATAACCCATGAA-3'，下游5'-GGGTCTGTGTGCCAGAATAATGAA-3'，PCR 產(chǎn)物179 bp，Muc5ac引物序列為上游5'-AATGACTCAATCTGCGTG-CCTTC-3'，下 游5'-GGCAGTCGATGCTAATGGTGTG-3'，PCR 產(chǎn)物13 5bp，β-actin 引物序列:上游5'-GGCCAACCGTGAAAAGATGA-3'，下 游 5'-CAGCCTGGATGGCTACGTACA-3'，PCR 產(chǎn)物168 bp。熒光定量PCR 反應(yīng)條件:95℃，10 s，預(yù)變性，95℃，5 s 變性，59.3℃，20 s，退火延伸，共40 循環(huán)，55℃～95℃，10 s，共81 個(gè)循環(huán)，融解。各樣本cDNA 進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 經(jīng)SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料經(jīng)± s 表示，均數(shù)比較經(jīng)方差分析。

2 結(jié)果

圖1 各組肺組織病理改變(HE 染色，×200)Fig.1 A pathological changes in lung tissue chart (HE stain，×200)

2.1 小鼠肺組織HE 染色病理改變(見(jiàn)圖1A-E)正常組小鼠支氣管管壁及其周?chē)M織結(jié)構(gòu)完整而清晰，未見(jiàn)或見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。地塞米松組及SB328437 組小鼠支氣管及周?chē)M織尚清晰，有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。AS 組和AS +DMSO 組見(jiàn)支氣管有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，杯狀細(xì)胞增生，管壁增厚，支氣管狹窄。

2.2 小鼠BALF 細(xì)胞計(jì)數(shù) 各組小鼠BALF 細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞分類(lèi)結(jié)果如表1 所示，AS 組BALF 細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞均較NS 組多(P 均＜0.01)，而單核細(xì)胞較NS 組有所減少(P 均＜0.05)。AS+SB 組和AS +DEX 組細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞與AS 組比較明顯減少(P 均＜0.05)，而較NS 組有所增加，AS +DEX 組細(xì)胞總數(shù)比AS+SB 組少，但其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

2.3 氣道組織AB-PAS 染色 結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.4 各組BALF 中IL-4、TNF-α 水平測(cè)定 如表2顯示，AS 組、AS+DEX 組、AS+SB 組BALF 中IL-4、TNF-α 與NS 組比較均增加，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);AS+DEX 組和AS +SB 組BALF 中IL-4、TNF-α 水平較AS 組減少，其差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Muc5ac 陽(yáng)性表達(dá)于支氣管管腔內(nèi)，其余肺組織未見(jiàn)表達(dá)。正常組、SB 組和地塞米松組Muc5ac 表達(dá)較低。

2.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠氣道組織Muc5ac表達(dá) 結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠肺組織CCR3 表達(dá)結(jié)果如圖4 所示，CCR3 陽(yáng)性表達(dá)見(jiàn)于氣道黏膜上皮細(xì)胞、黏膜下層平滑肌細(xì)胞及血管周?chē)鷥?nèi)皮細(xì)胞。CCR3 陽(yáng)性表達(dá)的部位主要定位于細(xì)胞膜，細(xì)胞漿也有少量表達(dá)。NS 組在上述部位僅少量表達(dá)。哮喘組可見(jiàn)大量CCR3 表達(dá)，SB 組和地塞米松組表達(dá)量較哮喘組和溶劑對(duì)照組減低，但仍高于正常組。

表1 各組小鼠BALF 細(xì)胞計(jì)數(shù)及白細(xì)胞分類(lèi)Tab.1 BALF cell counts in each group of mice and leukocyte

圖2 各組小鼠氣道組織AB-PAS 染色(AB-PAS 染色，×200)Fig.2 Airway tissues of mice in each group AB-PAS staining (AB-PAS staining，×200)

圖3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠氣道組織Muc5ac 表達(dá)(免疫組化，×200)Fig.3 Immunohistochemistry assay airway tissue Muc5ac expression (Immunohistochemistry，×200)

圖4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠肺組織CCR3 表達(dá)(免疫組化，×200)Fig.4 Immunohistochemical assay in mouse lung tissue CCR3 expression (immunohistochemistry，×200)

表2 各組BALF 中IL-4、TNF-α 水平測(cè)定Tab.2 BALF IL-4，TNF-α levels were measured in each group

表3 熒光定量RT-PCR 檢測(cè)小鼠氣道組織Muc5ac mRNA 及CCR3 mRNA 的表達(dá)Tab.3 Expression fluorescence quantitative RT-PCR to detect Muc5ac mRNA and CCR3 mRNA in airway tissue

2.7 熒光定量RT-PCR 檢測(cè)小鼠氣道組織Muc5ac mRNA 及CCR3 mRNA 的表達(dá) 熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3:As 組、AS +DMSO 組、AS +SB 組和AS+DEX 組小鼠氣道黏蛋白Mucsa mRNA 表達(dá)量較NS 組增高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，AS+DEX 組和AS +SB 組表達(dá)量較AS 組降低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

哮喘為遺傳因素與環(huán)境因素共同導(dǎo)致的氣道慢性炎癥。嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞都參與了氣道炎癥反應(yīng)［2］。其中嗜酸性粒細(xì)胞是為引發(fā)支氣管黏膜炎癥的主要效應(yīng)細(xì)胞，可導(dǎo)致氣道黏膜損傷與氣道阻塞［3］。嗜酸性粒細(xì)胞在骨髓內(nèi)分化，嗜酸性粒細(xì)胞特異性趨化因子(Eotaxin)屬C-C 趨化因子家族成員，通過(guò)與其唯一受體CCR3 結(jié)合后而發(fā)揮作用，能特異地聚集、趨化和激活嗜酸性粒細(xì)胞。嗜酸性粒細(xì)胞向炎癥部位趨化、活化和并經(jīng)脫顆粒釋放炎性介質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致氣道慢性炎癥與高反應(yīng)性。因此在氣道慢性炎癥與高反應(yīng)過(guò)程中脫顆粒釋放炎癥介質(zhì)為重要原因［4，5］。

趨化因子受體為G 蛋白偶聯(lián)蛋白，趨化因子受體分為CXCR、CCR、CR 和CX3CR。CCR3 是一個(gè)非特異性受體，主要表達(dá)于嗜酸性粒細(xì)胞上，Th2 細(xì)胞亞群、嗜堿粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、神經(jīng)組織及氣道上皮細(xì)胞均可檢測(cè)到CCR3。CCR3 可與趨化嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、Th2 淋巴細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞結(jié)合，然后誘導(dǎo)到哮喘患者炎癥部位，故該過(guò)程是哮喘的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)［6］，其中對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞的作用是這個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的主要步驟。但對(duì)于氣道高反應(yīng)性的影響目前尚存在爭(zhēng)議［7-9］。嗜酸性粒細(xì)胞脫離產(chǎn)物顆粒蛋白具有細(xì)胞毒作用，可經(jīng)刺激嗜酸性粒細(xì)胞或者其他炎癥細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致氣道炎癥的發(fā)生，加重了哮喘患者的病情。

因此可看出，在氣道炎癥與黏液高分泌中CCR3 扮演重要角色，阻斷CCR3 即可有效治療哮喘氣道炎癥與抑制氣道黏液高分泌。CCR3 拮抗劑可與嗜堿性粒細(xì)胞等表面的CCR3 相結(jié)合，阻斷嗜酸粒細(xì)胞的趨化因子結(jié)合CCR3，進(jìn)而有效避免炎癥細(xì)胞向氣道活化與募集。SB2328437 是一個(gè)分子量為387.4，對(duì)CCR3 有特異性選擇的高分子蛋白，可有效抑制CCR3 與配體(Eotaxin-1、2、3，RANTES，MCP-2、3、4 等)結(jié)合，進(jìn)而抑制對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的趨化，降低Th2 優(yōu)勢(shì)，并能抑制鈣離子內(nèi)流。新近研究表明，CCR3 拮抗劑可以抑制Eotaxin 引起Th2 細(xì)胞對(duì)小鼠肺浸潤(rùn)及過(guò)敏原誘導(dǎo)的支氣管收縮。離體外周血中SB328437(C21H18N2O5)可減少釋放輔助性T細(xì)胞(Th2)細(xì)胞因子［10］。

本研究顯示，與正常組相比，AS 組氣道炎癥顯著加重，在BALF 中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞，IL-4和TNF-α 表達(dá)水平，氣道AB-PAS 染色黏液物質(zhì)陽(yáng)性相對(duì)著色面積和免疫組化檢測(cè)肺組織Muc5ac 和CCR3 的IOD 值，CCR3 和Muc5ac 的mRNA 表達(dá)量較NS 組明顯增加。AS +SB328437 組病理學(xué)病變較AS 組明顯減輕，在BALF 細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞均較AS 組降低(P 均＜0.01)，但高于NS 組(P 均＜0.01)，說(shuō)明SB328437 可有效控制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)導(dǎo)致的氣道炎癥。BALF 中IL-4，TNF-α 表達(dá)水平較AS 組明顯減少(P＜0.01)，表明CCR3 可經(jīng)IL-4、TNF-α 等細(xì)胞因子作用在氣道黏液高分泌中起到重要作用。

本研究提示AS +SB328437 組在AB-PAS 氣道黏液物質(zhì)陽(yáng)性相對(duì)著色面積和免疫組化檢測(cè)肺組織Muc5ac、CCR3 的IOD 值均較AS 組明顯降低(P＜0.01)，但高于NS 組(P＜0.01)說(shuō)明SB328437 能夠有效抑制哮喘小鼠氣道黏液物質(zhì)的分泌。熒光定量RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，AS +SB328437 組CCR3 和Muc5ac 的mRNA 表達(dá)量增高，但均低于AS 組(P＜0.05)?；谝陨涎芯浚覀兛梢酝茖?dǎo)CCR3 能夠介導(dǎo)炎癥細(xì)胞向氣道浸潤(rùn)，募集，活化IL-4、TNF-α 等細(xì)胞因子，導(dǎo)致氣道炎癥和氣道黏液高分泌。SB328437 通過(guò)抑制CCR3 和炎癥細(xì)胞的結(jié)合，降低IL-4、TNF-α 表達(dá)，可控制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)而降低氣道炎癥與黏液高分泌，以防氣道重構(gòu)。

吸入糖皮質(zhì)激素(ICS)已經(jīng)成為哮喘的首選治療。大部分哮喘患者選擇ICS 與口服治療，療效良好，但對(duì)于少數(shù)糖皮質(zhì)依賴(lài)性或抵抗性的哮喘患者，應(yīng)找到有效藥物治療方式。而CCR3 小分子化合物拮抗劑對(duì)CCR3 有很強(qiáng)的選擇抑制性，從而阻止嗜酸性粒細(xì)胞炎癥的發(fā)生，它不同于傳統(tǒng)的抗炎藥，其不是在炎癥細(xì)胞進(jìn)入組織后見(jiàn)效，而是經(jīng)調(diào)整炎癥機(jī)制阻斷炎癥細(xì)胞進(jìn)入組織，其免疫抑制副作用相對(duì)更少。這樣顯現(xiàn)出其綜合優(yōu)勢(shì)，可將成為哮喘治療的主要趨勢(shì)。

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