單環(huán)刺螠中腸和后腸交替氧化酶對硫化物的應(yīng)激反應(yīng)?

任志強， 張立濤， 劉曉龍， 劉建國， 張志峰

(中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003)

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單環(huán)刺螠中腸和后腸交替氧化酶對硫化物的應(yīng)激反應(yīng)?

任志強， 張立濤， 劉曉龍， 劉建國， 張志峰??

(中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003)

外源性硫化物可通過抑制或阻斷線粒體電子傳遞經(jīng)典途徑而對生物體產(chǎn)生損傷甚至致死，交替氧化酶(Alternative Oxidase，AOX)是線粒體硫化物氧化電子傳遞分支途徑中的1個關(guān)鍵酶。為了研究硫化物環(huán)境中單環(huán)刺螠的生存對策，本文利用間接競爭性ELISA和酶活性分析等技術(shù)檢測了單環(huán)刺螠在硫化物應(yīng)激前后中腸和后腸中AOX的蛋白含量以及活性的變化。結(jié)果顯示：在未處理的單環(huán)刺螠中，后腸的AOX蛋白含量和酶活性均高于中腸。當(dāng)單環(huán)刺螠暴露在硫化物(50和150μmol·L-1)環(huán)境中時，2個器官的AOX含量和酶活性水平均隨著硫化物濃度的提高和暴露時間的延長而提高，并且150μmol·L-1硫化物處理組的單環(huán)刺螠2個器官AOX蛋白含量和酶活性普遍高于相同處理時間下的50μmol·L-1組。結(jié)合已報道的單環(huán)刺螠硫化物應(yīng)激下細(xì)胞色素c氧化酶活性的變化，提出單環(huán)刺螠體內(nèi)存在線粒體電子傳遞分支途徑；提高組織線粒體中AOX活性是其應(yīng)對環(huán)境硫化物毒性的對策之一。

單環(huán)刺螠； 交替氧化酶； 硫化物； 線粒體； 電子傳遞鏈

硫化物(H2S，HS-，S2-的總稱)是潮間帶底質(zhì)和水體中常見的有毒物質(zhì)，毫摩爾級濃度就可以對生物體產(chǎn)生毒害作用[1]。硫化物可以抑制線粒體電子傳遞鏈細(xì)胞色素c氧化酶的活性，從而阻止有氧呼吸的進行，進而導(dǎo)致生物體的死亡[2]。然而某些潮間帶無脊椎動物卻能夠在富含硫化物的環(huán)境中生存，已知沙蠋(Arenicolamarina)線粒體內(nèi)的交替氧化酶在此過程中起到了重要的作用[3]。

交替氧化酶(Alternative Oxidase，AOX)最早發(fā)現(xiàn)于1970年代，Bendall和Bonner在研究天南星科植物臭崧的抗氰化物呼吸時，發(fā)現(xiàn)該植物在氰化物處理下線粒體仍然能消耗氧，但該反應(yīng)可被水楊基羥肟酸所抑制，提出其線粒體中存在1條區(qū)別于經(jīng)典電子傳遞的途徑——交替氧化途徑，并將這一途徑的關(guān)鍵分子命名為交替氧化酶[4]。作為交替途徑的末端氧化酶，AOX通過在經(jīng)典電子傳遞鏈上建立支路，從而繞過復(fù)合體III和復(fù)合體IV，將上游傳遞過來的電子傳遞給氧，進而生成水[5]。AOX保持呼吸鏈電子流的傳遞及三羧酸循環(huán)(TCA)的正常運行，對生物體有重要的意義[6]。與經(jīng)典電子傳遞途徑中的細(xì)胞色素c氧化酶不同，AOX不將H+泵入線粒體膜間隙[7]，能量以熱能的形式散失[8]。已知AOX廣泛存在于植物、藻類、真菌和原生生物中，對于提高生物體的環(huán)境適應(yīng)能力，增強生物體抗逆性都具有重要的意義[9]。目前，關(guān)于AOX的研究多集中于植物領(lǐng)域。通過基因組數(shù)據(jù)庫可見AOX基因廣泛存在于海綿動物到脊索動物的各種動物類群中[10]，然而對于AOX在這些動物類群中的功能尚缺少清晰地認(rèn)識。

單環(huán)刺螠(Urechisunicinctus)俗稱海腸子，分布于中國黃渤海、俄羅斯、朝鮮和日本等沿海地帶，棲息于潮間帶泥沙底質(zhì)的U形洞穴中[11]。已有研究報道，單環(huán)刺螠具有耐受和代謝硫化物的能力[12-15]，并確定硫化物的應(yīng)激可引起單環(huán)刺螠aoxmRNA表達量的提高[16]。本實驗采用間接競爭性ELISA和酶活性分析等技術(shù)揭示了單環(huán)刺螠中腸和后腸中存在AOX線粒體電子傳遞通路，進一步分析了單環(huán)刺螠暴露在硫化物環(huán)境中2個器官AOX的適應(yīng)性反應(yīng)，為深入探討動物應(yīng)對硫化物的生存機制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

單環(huán)刺螠購自青島市四方路海產(chǎn)品市場，產(chǎn)地為煙臺沿海。選擇體表無傷痕，體態(tài)均一的健康個體(體重(28.1±7.4)g，體長(10.7±3.4)cm)，于實驗室暫養(yǎng)1周。每日換水1/2(溫度(21±2)℃，鹽度30±1，pH=8.0)，并投喂適量單細(xì)胞藻，實驗前一天停止投喂。

1.2 實驗分組與樣品處理

實驗設(shè)定3個組，包括2個實驗組(50μmol·L-1硫化物組、150μmol·L-1硫化物組)和1個對照組(不添加硫化物)，不同濃度的硫化物使用硫化物母液(Na2S·9H2O，10mmol·L-1)稀釋而成。實驗在密封的養(yǎng)殖玻璃缸中進行，每個實驗缸內(nèi)含60L不同硫化物濃度的過濾海水，每缸15個個體，每組設(shè)置3個平行缸，實驗期間每2h測定1次實驗水體硫化物濃度，通過補充硫化物母液以維持硫化物濃度的恒定。硫化物濃度按照亞甲基藍法測定[17]。分別于實驗的0、6、12、24、48和72h取樣，每缸隨機取樣2個個體，每組實驗動物數(shù)共計6個個體。解剖蟲體取中腸和后腸，液氮冷凍后，保存于-80℃冰箱中備用。

1.3 組織總蛋白提取和含量測定

單環(huán)刺螠中腸和后腸組織在冰浴中剪碎，電動勻漿器(Pro Scientific PRO 200，美國)勻漿。利用蛋白提取試劑盒(CW0891A，康為，北京)并按照操作指南提取中腸和后腸的總蛋白，于5000r/min離心，取上清即為總蛋白，保存于-20℃冰箱中。總蛋白含量以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)，采用考馬斯亮藍法測定[18]。

1.4 單環(huán)刺螠各組織AOX含量的測定

采用間接競爭性ELISA對單環(huán)刺螠中腸和后腸中AOX蛋白含量進行了測定。

利用碳酸鹽包被緩沖液(0.05mol·L-1,pH=9.6)對實驗室前期獲得的AOX蛋白進行稀釋，在酶標(biāo)板的每個孔中加入100μL稀釋后的AOX蛋白包被聚苯乙烯酶標(biāo)板，4℃過夜。棄包被液，PBST(PBS+0.5%Tween-20)清洗3次，每次3min。再向每孔中加入200μL的5%脫脂奶粉封閉抗原表位，37℃封閉1.5h。棄封閉液，PBST清洗3次，每次3min。在每孔中加入50μL稀釋后的一抗(AOX多克隆抗體)和50μL競爭抗原(單環(huán)刺螠組織總蛋白)，37℃孵育1.5h。棄孔內(nèi)液體，PBST清洗5次，每次3min。再向每孔中加入100μL稀釋后的二抗(羊抗兔酶標(biāo)抗體)，37℃孵育1h。去孔內(nèi)液體，PBST清洗5次，每次3min。最后利用TMB顯色試劑盒(Tiangen，北京)進行顯色，每孔加入100μL的顯色液，室溫下顯色，待孔中反應(yīng)液明顯變黃后加50μL 2mol·L-1的硫酸終止顯色反應(yīng)。最后利用酶標(biāo)儀在450nm下對各孔的吸光度進行測定。

1.5 組織線粒體提取和線粒體總蛋白含量測定

按照Sch?ttler的方法略加改動提取組織線粒體。400mg單環(huán)刺螠組織樣本中加入9倍體積預(yù)冷的線粒體提取緩沖液(58.4mmol·L-1蔗糖，140.2mmol·L-1甘氨酸，40mmol·L-1Tris，2mmol·L-1EGTA，0.2%牛血清蛋白，pH=7.5)，冰浴中剪碎，電動勻漿器(Pro Scientific PRO 200，美國)勻漿。3800g離心15min(4℃)，取上清，再11000g離心10min(4℃)，沉淀即為線粒體，然后重懸于提取緩沖液中[19]。線粒體總蛋白含量以BSA為標(biāo)準(zhǔn)，采用考馬斯亮藍法測定[18]。

1.6 交替氧化酶活性測定方法

利用clark型氧電極(Unisense，丹麥)在25℃下進行檢測，反應(yīng)體系為0.3mol·L-1蔗糖，10mmol·L-1的三羥甲基甲胺基乙磺酸(TES free acid)(pH=7.2)，5mmol·L-1KH2PO4，10mmol·L-1NaCl，2mmol·L-1MgSO4，0.1% (w/v) BSA。pH通過2mol·L-1HC1或2mol·L-1KOH調(diào)節(jié)。開始反應(yīng)時，反應(yīng)體系中加入0.1mmol·L-1ATP和0.5mmol·L-1KCN，待體系中讀數(shù)保持穩(wěn)定，迅速加入10mmol·L-1琥珀酸鈉，0.5mmol·L-1丙酮酸鈉，1mmol·L-1ADP等反應(yīng)底物，讀取耗氧速率值，利用0.2mmol·L-1沒食子酸丙酯(nPG)終止反應(yīng)[20]。在加入KCN抑制經(jīng)典電子傳遞鏈的情況下，以單位線粒體總蛋白的耗氧速率作為交替氧化酶活性的標(biāo)準(zhǔn)。每個取樣時間進行6個個體的樣本重復(fù)和2個平行的檢測。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±S.E.M.)表示。采用SPSS(Statistics Package for Social Science)17.0進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Tukey檢驗法統(tǒng)計分析，以P<0.05作為差異顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 單環(huán)刺螠中腸和后腸中AOX的表達和活性

間接競爭性ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)硫化物處理的單環(huán)刺螠后腸中AOX含量顯著高于中腸(P<0.05)，分別為0.12ng·μg-1(中腸)和0.25ng·μg-1(后腸)(見圖1A)。此外，未經(jīng)硫化物處理的單環(huán)刺螠后腸線粒體中AOX的活性顯著高于中腸(P<0.05)，分別為48.9nmol O2·min-1·mg-1和61.9nmol O2·min-1·mg-1(見圖1B)。

(圖中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=6；不同的字符表示2個數(shù)據(jù)之間存在顯著差異(P<0.05)。Data are indicated as mean ± S.E.M.,n=6; Different letters indicate significant differences between the mid-gut and the hindgut (P<0.05).)

圖1 單環(huán)刺螠中腸和后腸交替氧化酶的含量(A)和活性(B)
Fig.1 Content (A) and activity (B) of AOX in mid-gut and hindgut ofUrechisunicinctus

2.2 硫化物暴露下單環(huán)刺螠AOX的組織表達特征

當(dāng)暴露于硫化物環(huán)境中時，單環(huán)刺螠中腸和后腸中的AOX蛋白含量均隨著硫化物暴露時間的延長和硫化物濃度的增加而增加(見圖2)。150μmol·L-1硫化物處理24h后，2個器官的AOX表達量相對于對照組均呈顯著性提高(P<0.05)，中腸提高了2.4倍，后腸提高了6.3倍。150μmol·L-1硫化物處理72h后，AOX表達量進一步提高，分別達到了5.8倍(中腸)和12.9倍(后腸)。50μmol·L-1硫化物處理組，AOX蛋白表達量普遍明顯低于150μmol·L-1硫化物組。

(圖中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=6；不同字母表示在組間存在顯著性差異(P<0.05)。Data are indicated as mean±S.E.M.,n=6. Different letters indicate significant differences among different groups (P<0.05).)

圖2 硫化物暴露下單環(huán)刺螠中腸(A)和后腸(B)交替氧化酶的含量變化
Fig.2 Content changes of AOX in mid-gut (A) and hindgut (B) ofUrechisunicinctusexposed to sulfide

2.3 硫化物暴露下單環(huán)刺螠組織線粒體AOX的酶活性變化

當(dāng)單環(huán)刺螠暴露在硫化物環(huán)境中時，其中腸和后腸線粒體AOX活性隨著硫化物濃度的升高和處理時間的延長逐漸升高。50μmol·L-1硫化物處理組中2個組織線粒體AOX酶活性的提高程度均較150μmol·L-1組的低，并且起始發(fā)生變化的時間也較150μmol·L-1硫化物組晚(見圖3)。50μmol·L-1硫化物實驗組，單環(huán)刺螠在處理48h時其后腸的AOX活性均較對照組顯著提高(P<0.05)，為對照組的1.44倍；中腸于處理24h時出現(xiàn)顯著增加(P<0.05)，為對照組的1.37倍(見圖3(A),(B))。150μmol·L-1硫化物處理組中的AOX酶活性均在單環(huán)刺螠暴露6h時出現(xiàn)顯著地提高(P<0.05)，中腸和后腸線粒體的AOX酶活分別是對照組的1.6倍和1.9倍。72h時達到最高，分別為3.2倍(中腸)、2.3倍(后腸)(見圖3(C),(D))。單環(huán)刺螠2個組織在應(yīng)對硫化物環(huán)境時其交替氧化途徑的能力是不同的，中腸較后腸對硫化物更敏感：硫化物處理時，中腸AOX活性的對硫化物的反應(yīng)速度和增加的幅度都高于后腸。

(酶活性為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=6；*表示與同一時間對照組有顯著差異(P<0.05)。(A)、(B)為50μmol·L-1硫化物處理組；(C)、(D)為150μmol·L-1硫化物處理組。Activity value is the mean±S. E.M.,n=6; * indicates a significant difference between the treatment and the control at the same time (P<0.05). (A), (B): 50 μmol·L-1sulfide; (C), (D): 150 μmol·L-1sulfide.)

圖3 暴露于硫化物中的單環(huán)刺螠中腸和后腸交替氧化酶活性
Fig.3 Activity of AOX in mid-gut and hindgut ofUrechisunicinctusexposed to sulfide

3 討論

硫化物通過與細(xì)胞色素c氧化酶(Cytochromecoxidase, CCO)中細(xì)胞色素aa3上的血紅素卟啉環(huán)Fe3+可逆性結(jié)合阻礙其還原成為含F(xiàn)e2+的還原型氧化酶，從而抑制細(xì)胞色素c氧化酶的活性[1]，進而減弱或阻斷線粒體經(jīng)典途徑的電子傳遞，導(dǎo)致多余電子的積累和活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的增加，破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境氧化還原態(tài)的穩(wěn)定，導(dǎo)致其細(xì)胞生理功能的不利影響，并產(chǎn)生有機體的損傷[21]。Wagner等在研究天南星科植物魔芋的呼吸鏈時，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)蜏貤l件下經(jīng)典電子傳遞鏈?zhǔn)艿揭种疲珹OX通過接受呼吸鏈上游泛醌的電子，傳遞給氧生成水，這一過程保證了呼吸鏈電子傳遞的暢通，避免了ROS的積累并維持了TCA循環(huán)的正常進行[22]。綜上可見AOX的存在對生物體正常生存于高濃度的硫化物環(huán)境中起到重要的作用。

已有研究報道，單環(huán)刺螠暴露在一定濃度的硫化物中，其組織線粒體的細(xì)胞色素c氧化酶(CCO)活性明顯下降[12]。其中50μmol·L-1硫化物處理組單環(huán)刺螠體壁和后腸分別于暴露72和48h時CCO活性均較對照組顯著降低，分別降低了約60%和25%[16]。本實驗發(fā)現(xiàn)，相同硫化物濃度處理的單環(huán)刺螠后腸AOX酶活性在暴露48和72h時呈現(xiàn)顯著性提高。類似的aoxmRNA表達特點也在Huang等的研究中被報道[16]。表明單環(huán)刺螠體內(nèi)的確存在AOX電子傳遞途徑。進一步，150μmol·L-1硫化物中暴露24h后體壁和后腸的CCO活性均顯著低于對照組，單環(huán)刺螠體壁和后腸CCO活性較對照組顯著降低了60%和50%[16]，這一降低幅度較50μmol·L-1程度更高，說明此硫化物濃度下經(jīng)典電子通路被大幅度降低甚至抑制。此時AOX酶活在硫化物處理6h后較之對照組顯著提高，繼續(xù)處理AOX活性持續(xù)提高。這表明此時線粒體中的電子傳遞很大程度上由交替氧化途徑所替代。綜上可以得出，單環(huán)刺螠體內(nèi)存在交替氧化途徑，當(dāng)電子傳遞由于環(huán)境硫化物抑制CCO活性而受到阻礙時，其體內(nèi)的AOX通過交替氧化途徑傳遞電子，以此降低ROS對單環(huán)刺螠的損傷。

比較硫化物應(yīng)激下單環(huán)刺螠中腸和后腸AOX蛋白含量和AOX酶活性可以看出，兩者均隨硫化物暴露時間的延長和硫化物濃度的提高而提高，并且AOX酶活性的提高與其蛋白含量的增加規(guī)律是一致的，表明AOX在硫化物應(yīng)激下酶活性的提高主要是通過提高該蛋白的表達量來實現(xiàn)的。這不同于植物中的AOX。在煙草等植物中發(fā)現(xiàn)，AOX酶活性的提高既可以通過增加AOX蛋白的含量，同時還存在AOX結(jié)構(gòu)改變提高其活性的機制[23]。植物中AOX有單體和二聚體2種形式，單體形式的AOX具有活性；二聚體由2個單體通過二硫鍵結(jié)合形成，二聚體AOX喪失活性[24]。在動物中，人們發(fā)現(xiàn)其AOX氨基酸序列N端缺少植物中參與二聚體的二硫鍵形成的關(guān)鍵氨基酸—半胱氨酸，由此動物中的AOX不存在二聚體形式[25]。單環(huán)刺螠AOX序列中，同樣也不存在這一關(guān)鍵的氨基酸，因此也就可以解釋單環(huán)刺螠中腸和后腸AOX酶活性在硫化物應(yīng)激下的提高主要是通過提高AOX的蛋白表達量的機制。至于是否存在著硫化物對AOX蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生其他影響而影響其活性，有待進一步探索和驗證。

分析本實驗中單環(huán)刺螠中腸AOX對硫化物暴露的酶活性變化較后腸更敏感的現(xiàn)象，認(rèn)為這可能與2個器官在單環(huán)刺螠中的空間位置有關(guān)。單環(huán)刺螠為濾食性動物，含有餌料和硫化物的海水依次由口經(jīng)過食道、嗉囊、砂囊、中腸、后腸和直腸，并由肛門排出體外[26]。其消化道長而迂回，約占體長的5倍[27]，中腸是單環(huán)刺螠消化和吸收的主要部位，約占消化道長度的60%[28]。后腸在充水后其腸壁將變?yōu)閱螌?，是發(fā)生氣體交換的場所，因此又稱呼吸腸[26]。已有研究報道，當(dāng)單環(huán)刺螠暴露在硫化物環(huán)境中，其中腸和后腸均參與了硫化物的氧化解毒過程，并產(chǎn)生電子進入呼吸鏈[13-14]。根據(jù)分布位置，中腸較后腸更早和更多地接觸硫化物，中腸線粒體的經(jīng)典電子傳遞鏈較后腸線粒體更早地受到影響，因此中腸線粒體AOX的酶活性敏感度要高于后腸。

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責(zé)任編輯 朱寶象

Response of Alternative Oxidase in the Mid-Gut and Hindgut ofUrechisunicinctusAfter Sulfide Stress

REN Zhi-Qiang, ZHANG Li-Tao, LIU Xiao-Long, LIU Jian-Guo, ZHANG Zhi-Feng

(The Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Exogenous sulfide can damage or even kill the organism by inhibiting or blocking classical pathway of mitochondrial electron transport (MET), while alternative oxidase as a key enzyme, conducts a branch pathway of the sulfide oxidation MET. In order to study the animal's survival countermeasures to sulfide environment, in this study we determined the protein expression and activity change of alternative oxidase (AOX) in the mid-gut and hindgut ofUrechisunicinctusbefore and after sulfide stress by indirect competitive ELISA, and AOX enzyme activity analysis. The result showed: it was detected that the presence of AOX protein and enzyme activity in mid-gut and hindgut, which were higher in hindgut than mid-gut. When exposed at 50 and 150 μmol·L-1sulfide, the AOX protein amount and enzyme activity in mid-gut and hindgut both increased with elevation of sulfide concentration and delay of sulfide exposure time. AOX expression and activity in the 2 tissues exposed in 150 μmol·L-1is almost higher than that of 50 μmol·L-1. Combining with changes of activity of cytochromecoxidase which has been reported inU.unicinctusexposed to sulfide, we discussed the role of AOX in 2 tissues ofU.unicinctusexposed to different concentrations of sulfide, and suggested that an AOX branch pathway of MET existed inU.unicinctus, and the increase of the AOX activity was one of strategy for response to the toxicity of environment sulfide in the worm.

Urechisunicinctus; alternative oxidase; sulfide; mitochondria; electrons transport chain

國家自然科學(xué)基金項目(31072191)資助

2013-10-31；

2014-04-02

任志強(1987-)，男，碩士生，研究方向：細(xì)胞生物學(xué)。

?? 通訊作者： E-mail: zzfp107@ouc.edu.cn

Q554+.9

A

1672-5174(2015)02-066-06

10.16441/j.cnki.hdxb.20130400