兔聲帶注射脫細胞真皮基質(zhì)和自體脂肪的實驗研究

郝媛媛孫建軍，2

·實驗研究·

兔聲帶注射脫細胞真皮基質(zhì)和自體脂肪的實驗研究

郝媛媛1孫建軍1，2

目的 探討自體脂肪和脫細胞真皮基質(zhì)（acellular dermal matrix，ADM）聲帶填充的臨床應用價值。方法 16只新西蘭兔建立單側(cè)聲帶麻痹模型后，隨機分為脂肪組（麻痹側(cè)聲帶注射自體脂肪）和ADM組（麻痹側(cè)聲帶注射ADM），每組8只。每組動物于聲帶注射術后2、4、8和12周各取2只行纖維喉鏡檢查觀察聲帶形態(tài)變化后，處死動物并取出全喉，沿喉軸位自室?guī)е谅曢T下連續(xù)切片，進行HE染色，高倍光學顯微鏡下觀察填充材料組織學改變，并使用autoCAD軟件進行填充材料剩余體積估算。結(jié)果 兩組的聲帶填充材料剩余體積均隨時間逐漸縮小，縮小的速度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。脂肪組自體脂肪注射術后2周可見成活的脂肪細胞呈團塊狀分布，與周圍組織未形成較明顯分界，后成活的脂肪細胞逐漸減少，代之以纖維結(jié)締組織相連的多個大泡，四周存活少量的脂肪細胞；術后3月脂肪團塊周圍被纖維結(jié)締組織包繞，形成明顯的包膜。ADM組術后2周微粒間可見成纖維細胞長入及新生血管形成，隨后成纖維細胞逐漸增多，術后3月植入的ADM團塊仍可見基本輪廓，組織結(jié)構(gòu)較致密，但與周圍組織界限不明顯。結(jié)論 兔聲帶注射自體脂肪和ADM后的吸收速率無顯著差異，但ADM植入后組織相容性好，可逐漸被原有組織改建、替代，作為聲帶注射填充材料有較大的發(fā)展空間和臨床應用價值。

聲帶麻痹； 聲帶注射； 自體脂肪； 脫細胞真皮基質(zhì)

聲帶填充注射喉成形術（injection laryngoplasty，IL）是臨床常用于治療聲帶萎縮、聲帶麻痹、聲帶瘢痕、聲帶溝以及環(huán)杓關節(jié)固定等疾病所致聲門閉合不全的有效手段之一，其原理系將自體組織材料、同種異體材料或人工生物材料通過局部注射方式，填充到聲帶組織不同層次或聲帶旁間隙，依其容積效應糾正聲門閉合不全，不同程度復原聲帶振動特性，改善發(fā)聲功能［1］。近年來生物材料的發(fā)展與優(yōu)化為臨床提供了更多的選擇，然而不同材料在組織重塑效果、作用持續(xù)時間、聲帶振動特性以及安全性和并發(fā)癥等方面的差異使得不同材料作為聲帶填充物的選擇仍然存在爭議。

目前常用的聲帶填充材料中，自體脂肪組織作為一種安全、有效的材料在臨床得到了廣泛應用；而根據(jù)國外文獻報道，脫細胞真皮基質(zhì)（acellular dermal matrix，ADM）用于聲帶注射已有十余年歷史，其材料來源、使用效果、安全性與穩(wěn)定性受到了肯定［2］，然而，對于自體脂肪和ADM的比較研究卻鮮有報道。為此，本研究擬通過建立喉返神經(jīng)損傷致聲帶麻痹動物模型，觀察自體脂肪、ADM微粒植入聲帶后的存留時間、重塑特性及組織學改變，探討這兩種材料用于聲帶注射填充的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選擇健康成年新西蘭兔16只，雌雄不限，體重2.0～3.0 kg。實驗前均經(jīng)纖維喉鏡檢查，確定其聲帶形態(tài)及運動正常。16只實驗動物隨機分為脂肪組（麻痹側(cè)聲帶注射自體脂肪）和ADM組（麻痹側(cè)聲帶注射ADM），每組8只。

1.2 聲帶麻痹動物模型制備 將速眠新Ⅱ號注射液和氯胺酮注射液1：1混合后，對兩組動物行肌肉注射麻醉（0.35～0.45 ml／kg）。動物麻醉固定后術區(qū)備皮、消毒，取頸部正中縱行切口，暴露甲狀腺，翻開甲狀腺左葉，找到左側(cè)甲狀腺下動脈原伴行于該血管的喉返神經(jīng)，切除1 cm喉返神經(jīng)，斷端局部筋膜包埋，縫合切口［3］。術后立即使用纖維喉鏡檢查，以左側(cè)聲帶隨呼吸節(jié)律無活動、聲帶縮短呈弓形即為造模成功（圖1），觀察2周后進行后續(xù)實驗。

1.3 聲帶注射材料的制備及注射方法

1.3.1 自體脂肪制備 左側(cè)聲帶麻痹造模成功2周后，脂肪組動物麻醉后，取腹部縱行切口，依次分離皮下、肌肉組織，打開腹腔，切取2 cm×2 cm× 0.5 cm大網(wǎng)膜脂肪組織，將血管去除，置于生理鹽水中漂洗，然后用剪刀剪碎，將細顆粒糊狀的脂肪組織1 ml放入1 ml注射器中備用。

1.3.2 ADM注射材料制備 將同種異體脫細胞真皮基質(zhì)補片（由北京清源偉業(yè)生物組織工程科技有限公司提供）用物理方法切割成約100μm×100 μm×100μm微粒，每100 mg分裝入5 ml注射器內(nèi)，Co60輻照滅菌。將微粒狀ADM與溶媒（0.5%普魯卡因）按0.1 g：0.8 ml制備，放入1 ml注射器中備用。

1.3.3 聲帶注射填充方法 兩組動物全身麻醉固定后，術區(qū)消毒，頸部縱行切開，暴露甲狀軟骨，緊貼甲狀軟骨下緣中點向左2～5 mm處，斜上方向進針，將針頭刺入聲門旁間隙，同時，經(jīng)口插入纖維喉鏡，直視下移動針頭并置于聲帶突尖端的外側(cè)注射0.15 ml自體脂肪或ADM［4］。注射完畢動物常規(guī)復蘇后正常飼養(yǎng)，觀察動物進食、呼吸等情況。

1.4 聲帶形態(tài)觀察 兩組動物于聲帶注射填充術后第2、4、8、12周各取2只進行纖維喉鏡檢查，觀察注射側(cè)聲帶的形態(tài)及運動。

1.5 光鏡下觀察及填充物體積評估 各組在上述各時間點完成纖維喉鏡檢查后，分別處死該2只動物，取出全喉，置于10%福爾馬林液體中固定24小時。常規(guī)石碏包埋，沿喉軸位自室?guī)е谅曢T下全喉連續(xù)切片，每500μm切片1張，進行HE染色。高倍光學顯微鏡下觀察填充物的細胞及微粒形態(tài)、填充物體積、是否發(fā)生異物反應、與周圍組織關系等。參考Seong KK的方法，使用autoCAD軟件計算每張切片中注射材料的體積（圖2）。注射材料的體積按照下列公式估算，體積＝剩余面積／每張×切片張數(shù)×0.5 mm［3］。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，組間比較用兩獨立樣本的t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 注射側(cè)聲帶形態(tài) 自體脂肪與ADM微粒注射術后聲帶均未見明顯炎癥反應。術后及2周均可見術側(cè)聲帶體積飽滿，術后4周后聲帶體積明顯縮小，脂肪組和ADM組術側(cè)聲帶體積縮小速度同步，術后12周兩組術側(cè)聲帶注射部位稍隆起，與健側(cè)對比差別不明顯（圖2、3）。

2.2 光鏡下觀察 脂肪組自體脂肪注射術后2周

在聲帶肌層可見填充物周圍伴有炎性反應，可見成活的脂肪細胞呈團塊狀分布，與周圍組織未形成較明顯分界，術后4周炎性反應基本消失；術后8周，植入脂肪組織主要為多個囊腔，其間以纖維結(jié)締組織相連，夾雜少量存活的脂肪細胞；術后12周，存活的脂肪細胞進一步減少，脂肪團塊周圍被纖維結(jié)締組織包繞，形成明顯的包膜（圖4）。ADM組注射ADM術后2周，微粒間可見大量成纖維細胞長入及新生血管形成，并見炎性反應；術后4周，炎性反應基本消失，成纖維細胞逐漸增多，細胞核較大，并呈卵圓形，ADM微粒與重建后的基質(zhì)區(qū)別明顯；術后8周，成纖維細胞數(shù)量減少并且細胞核變小，ADM微粒較少，新生基質(zhì)排列緊密；術后12周，ADM微?；鞠В植勘恍律z原代替，新生膠原排列致密、整齊，ADM團塊可見基本輪廓，但與周圍組織界限不明顯；ADM植入后均未見異物巨細胞反應（圖5）。

2.3 注射材料體積變化 兩組聲帶注射填充的材料體積均隨時間逐漸縮小，速度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

圖1 聲帶麻痹模型制備前后聲帶形態(tài)

圖2 脂肪組左側(cè)聲帶自體脂肪注射后纖維喉鏡下聲帶形態(tài)

圖3 ADM組左側(cè)聲帶ADM微粒注射后纖維喉鏡下聲帶形態(tài)

圖4 脂肪組自體脂肪植入后聲帶組織光鏡觀察圖

圖5 ADM微粒植入后光鏡觀察圖

表1 兩組自體脂肪和ADM微粒聲帶注射后不同時間填充物體積比較（像素，±s）

表1 兩組自體脂肪和ADM微粒聲帶注射后不同時間填充物體積比較（像素，±s）

組別2周4周8周12周脂肪組3 036.412 2±158.308 8 2 160.803 2±66.539 7 1 528.875 6±134.494 5 1 214.2948±509.617 9 ADM組4 174.722 0±336.803 9 2 267.089 0±312.587 9 1 646.202 9±121.827 6 1 074.5765±144.215 2

3 討論

1911年Brunings首次提出應用IL治療單側(cè)聲帶麻痹，但是受材料和當時外科技術的限制并未得到廣泛應用。隨著注射技術和新型材料的發(fā)展，IL的作用得到了重新認識，其適用范圍也在逐漸拓展，新型生物材料的發(fā)展與優(yōu)化既為臨床提供了更多的選擇，但也使得對于何謂最佳材料的認知普遍存在爭議。

自體脂肪組織無排斥反應，能為聲帶提供良好的振動特性且取材相對容易，是目前臨床應用最廣泛的聲帶填充材料。Guven的研究顯示，自體脂肪IL術后患者聲門閉合、粘膜振動、喉粘膜感知功能、整體嗓音評級、聲學和空氣動力學評估均有不同程度提高，術后發(fā)聲也有改善；隨訪1年后所有患者的吞咽功能均有改善［5］。但是自體脂肪組織的應用尚存在一些爭議，其中吸收率問題尤為突出；與之相關的問題是自體脂肪獲取方式、確定最初和最終填充物體積的方法影響吸收率的計算，因此，有關其實際的吸收率和持續(xù)存留時間各家報道不同，但是對于自體脂肪高吸收率均持一致觀點［6～8］。Laccourreye認為自體脂肪聲帶注射雖然是有效和安全的手術方式，但是注射后的吸收量和效果的持續(xù)時間難以預測，與之相比喉成形術具有良好和穩(wěn)定的治療效果，因此一定程度上減少了自體脂肪聲帶注射的使用［］。

近年發(fā)展起來的脫細胞真皮基質(zhì)（acellular dermal matrix，ADM）系利用物理、化學、生物等方法將同種異體或異種組織進行脫細胞、除抗原等處理，最終獲得具有弱免疫抗原性的生物材料，目前已在組織工程、器官修復和重建、整形美容等領域廣泛應用［10］。ADM作為多種膠原與彈性蛋白的復合物，利于成纖維細胞、內(nèi)皮細胞的生長和血管的再生，最終使材料與受體組織完全一體化。有關ADM膠原網(wǎng)架轉(zhuǎn)歸的研究發(fā)現(xiàn)，ADM并非停留于基質(zhì)狀態(tài)，而是隨應用部位的不同被改建為適宜的局部組織［11］。Tan等［2］的一項10年回顧性研究顯示，ADM對促進聲門閉合、保護氣道、改善患者發(fā)聲都有很好的作用；同時對患者創(chuàng)傷小，能減少實施永久性手術的概率，1年以上隨訪者中48%患者發(fā)聲仍較滿意。ADM具有存留時間長、改善發(fā)聲效果好、生物相容性好、易注射、無創(chuàng)的優(yōu)點，短效和長效聲帶注射填充都適用。

文中結(jié)果顯示，自體脂肪和ADM聲帶注射填充后均發(fā)生較快的吸收，兩者吸收速率無統(tǒng)計學差異。分析自體脂肪的吸收原因，多與局部未能及時建立血供，導致脂肪細胞壞死、吸收有關。ADM微粒無細胞成分，即使受區(qū)血供較差，也應不易出現(xiàn)液化、吸收。然而，本研究中發(fā)現(xiàn)ADM聲帶注射后吸收也較快，考慮可能與使用的濃度和材料粒徑有關；Sclafani［12］的研究中發(fā)現(xiàn)，ADM微粒皮下注射較皮內(nèi)注射吸收明顯加快，以此推測可能是皮下疏松結(jié)締組織或?qū)е挛⒘８斓碾x散，微粒間距離擴大加速了ADM的吸收，因此，增加ADM濃度或許可以減慢其吸收。目前，ADM注射的適宜濃度沒有統(tǒng)一的標準，臨床應用中商品化的產(chǎn)品如Cymetra的配比是將330 mg ADM微粒加入1～2 ml的1%利多卡因［2，13］；其他動物實驗報道多在150～600 mg／ml之間［12，14］，但是關于不同濃度注射的對比未見報道。ADM粒徑大小影響其降解和注射，粒徑小于52μm的微粒，更易被宿主細胞吞噬降解，但粒徑過大則不易注射［12］。另外，局部肌肉收縮、植入物受壓也可能影響其吸收速率。

從文中結(jié)果看，兩種注射材料聲帶注射后組織學轉(zhuǎn)歸差異較大，自體脂肪組織隨時間推移，存活脂肪細胞逐漸減少，代之以被纖維結(jié)締組織連接的囊腔，12周時殘留脂肪細胞數(shù)量極少，并且周圍形成明顯包膜，組織學形態(tài)與周圍組織差別明顯；而ADM植入后，隨時間推移，成纖維細胞逐漸長入ADM微粒間，并伴新生血管形成，未見異物巨細胞反應，提示ADM組織相容性良好，在植入體內(nèi)成纖維細胞合成膠原纖維和基質(zhì)的同時ADM微粒自身降解，其與周圍組織界限不明顯。可見，ADM植入后的轉(zhuǎn)歸是逐漸被宿主原有組織改建、替代。此外，相對于自體脂肪組織，ADM注射創(chuàng)傷小、獲取方便（無供體取材創(chuàng)傷），并且局麻下也可實施操作，具有明顯優(yōu)勢。由此可見，ADM作為聲帶填充注射材料，未來有較大的拓展空間和臨床應用價值。

ADM最初并非專為聲帶填充注射而設計，目前臨床上用于聲帶注射的ADM制品多是通過物理方法將其進行微?；幚?，使其具備可注射性；與自體脂肪材料相比，注射ADM的填充的效果差異并不明顯，因此，對ADM材料制備的優(yōu)化策略，如：通過提高制作技術以延緩降解，或者進一步明確適宜的粒徑、注射濃度及與其他材料復合使用，將是未來

此類材料研究的熱點與方向。

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3 Kwon SK，Song JJ，Cho CG.Polycaprolactone spheres and theromosensitive Pluronic F127 hydrogel for vocal fold augmentation：in vivo animal study for the treatment of unilateral vocal fold palsy［J］.Laryngoscope，2013，123：1694.

4 Mallur PS，Rosen CA.Office-based laryngeal injections［J］. Otolaryngol Clin North Am，2013，46：85.

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13 Maloney BP，Murphy BA，Cole HP.Cymetra［J］.Facial Plast Surg，2004，20：129.

14 趙大華，趙鴻儒，孫亦軍.異種（豬）脫細胞真皮基質(zhì)微粒與自體脂肪顆粒移植的對比研究［J］.中國美容醫(yī)學，2006，2：129.

（2015-02-26收稿）

（本文編輯 周濤）

Experimental Study on Acellular Dermal Matrix and Autologous Fat lnjected into Rabbit Vocal Cords

Hao Yuanyuan，Sun Jianjun
（Navy Clinical College，Anhui Medical University，Beijing，100048，China）

Objective To evaluate the clinical application of autologous fat and acellular dermal matrix（ADM）in vocal fold medialization.Methods A total of 16 New Zealand white rabbits of both sexes were divided into two study groups（8 rabbits in each group），after unilateral recurrent laryngeal nerve section，autologous fat or ADM were injected into paralyzed vocal folds.Laryngoscopic exams were performed 2，4，8，and 12 weeks after implantation；then larynx specimens were sampled and serially sectioned in axial plane from the false vocal fold to the subglottis.After section was stained with HE，histologic behavior of the graft were evaluated by optical microscope，volume of remaining material were calculated by autoCAD software.Results The remaining volume of autologous fat and ADM reduced gradually，there were no statistically significant differences between the 2 groups.In 2 weeks，fat cells survival was mass distribution，as its necrosis and absorption，intraimplant resulted in a plurality of cavitation，encapsulated by fibrous connective，mixed with a little survival fat cells.In 12 weeks，obvious capsule formation surrounded lipoma composed of fiber connective tissue.In the ADM group，2 weeks after injection，intra-implant fibroblast activity and neovascularization was noted，later fibroblast infiltration increased gradually.In 12 weeks，the implantation maintaun the basic outline and have compact organizational structure，but not forming obvious boundaries with the surrounding tissue.Conclusion Comparing degree of absorption，there were no statistically sig nificant

Vocal cord paralysis； Vocal fold medialization； Autologous fat； Acellular dermal matrix

10.3969／j.issn.1006-7299.2015.04.013

時間：2015-6-17 9：54

R767.6+2

A

1006-7299（2015）04-0386-05

1 安徽醫(yī)科大學海軍臨床學院（北京 100048）； 2 海軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

郝媛媛，女，河南人，碩士研究生，主要研究方向為言語疾病.

孫建軍（Email：jjsun@sina.com）

網(wǎng)絡出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20150617.0954.004.html

differences between autologous fat and ADM in the study，but histological outcome of ADM is closer to the original organization.In future，ADM optimization or combination with other materials，will have a larger development and clinical application value.