粉塵螨α-烯醇化酶基因的克隆表達、純化及其N端B細胞表位的初步鑒定

羅文麗,邱聰齡,余煒嘉,劉志剛,2,吉坤美,2,蔡澤浪,2

粉塵螨α-烯醇化酶基因的克隆表達、純化及其N端B細胞表位的初步鑒定

羅文麗1,邱聰齡1,余煒嘉1,劉志剛1,2,吉坤美1,2,蔡澤浪1,2

目的 克隆表達粉塵螨(Dermatophagoidesfarinae)α-烯醇化酶(alpha-enolase，ENOA)基因，初步研究其N端B細胞表位與自身免疫性疾病的關系。方法 ①設計特異性引物，從文庫中克隆ENOA cDNA；②通過BamH I/EcoR I雙酶切位點，將ENOA基因克隆至pET-His原核表達載體，表達純化，獲得了重組ENOA蛋白；③測定重組ENOA酶活性；④通過Swiss-Model軟件模擬ENOA蛋白3D結構，并分析其潛在的N端B細胞表位；合成ENOA的N端表位肽，測定其與類風濕性關節(jié)炎患者血清IgG的反應性。結果 ①克隆了ENOA全長cDNA (GenBank 登錄號KJ421213.1)；②成功構建了pET-His-ENOA 表達載體，經純化獲得了重組ENOA蛋白。③重組蛋白具有烯醇化酶活性；④瓜氨酸修飾的合成表位肽與類風濕性關節(jié)患者血清IgG-ELISA呈陽性反應，與健康對照組血清均不呈反應(P<0.05 )。結論 本課題首次克隆表達的重組ENOA蛋白具有烯醇化酶活性；其N端B細胞表位與類風濕性關節(jié)炎相關。本研究為塵螨與自身免疫性疾病的相關性研究提供了新的思路。

粉塵螨；α-烯醇化酶；類風濕性關節(jié)；表位

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自身免疫性疾病如類風濕性關節(jié)等患者機體存在一類抗體，對自身抗原發(fā)生免疫反應而損害自身組織[1]。研究發(fā)現(xiàn)α-烯醇化酶(α-Enolase，ENOA)不僅是體內參與糖酵解途徑的催化酶，而且作為一個多功能的分子參與人類自身免疫性疾病、過敏性疾病以及癌癥等多種疾病的病理生理過程。Rattner等首次報道了系統(tǒng)性風濕疾病患者體內存在抗α-Enolase抗體[2]?？功?Enolase的自身抗體通過識別膜結合形式的α-Enolase從而干擾其功能導致誘發(fā)局部的炎癥反應[3]。Andrew Kinloch等[4]研究表明類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)患者體內也存在抗α-Enolase抗體，α-Enolase可發(fā)生瓜氨酸化，從而刺激生物體產生自身抗原特異的抗體。此外，紅斑狼瘡患者血清與重組酵母α-Enolase具有交叉抗原抗體結合反應[5]。

塵螨是最主要的室內吸入性致敏原，可引起多種過敏性疾病，如過敏性哮喘、過敏性鼻炎等。致敏塵螨物種主要包括粉塵螨(Dermatophagoidesfarinae，Der f)和屋塵螨(Derpmaatophagoidespteronyssinus，Der p)[6-7]等，目前已經分離鑒定并正式命名了24組塵螨過敏原成份，它們與過敏性疾病的關系比較明確[8]。但塵螨與自身免疫性疾病是否相關尚待研究[9-10]。本課題在解析了粉塵螨轉錄組的基礎上[8]，通過同源比對尋找到粉塵螨α-烯醇化酶cDNA序列，進行了克隆和表達，并初步探討它是否存在交叉抗原表位，從而與類風濕性關節(jié)炎ENOA自身抗體反應。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與材料 實驗中使用的粉塵螨(Dermatophagoidesfarinae)cDNA文庫和大腸埃希氏菌E.coliTOP10、表達載體pET-His vector由深圳大學過敏反應與免疫學研究所保存。質粒提取、瓊脂糖凝膠DNA回收、DNA Marker、LA Taq DNA聚合酶、BamH I及EcoR I、T4 DNA ligase購自TaKaRa公司，蛋白分子量Marker購自Fermentas公司， Ni2+-Chelating Sepharose及層析柱購自GE公司。其余試劑均為國產或進口分析純試劑。

1.1.2血清 64例RA患者血清及26例健康對照血清標本來源于深圳市第二人民醫(yī)院，其中，RA血清標本：男34例，女30例，年齡26～72歲；健康對照血清標本：男15例，女11例，年齡22～60歲。

1.2實驗方法

1.2.1粉塵螨ENOA的 cDNA克隆 根據同源比對分析結果，在粉塵螨基因組中找到編號(Locus tag)為DEFA_132640的ENOA對應的同源基因。以粉塵螨cDNA文庫為模板，根據ENOA的序列設計特異性PCR引物，上游和下游引物的序列分別為：

5’-ATGTCCATTCAAAAGATTTATG-3’，5’-TTAAATTGGATGACGGAAATTT -3’。通過PCR得到產物，電泳檢測并切膠回收，經轉化克隆到pMD19-T載體上挑取單菌落，進行Sanger雙向測序，分析測序結果。

1.2.2粉塵螨ENOA編碼基因的人工合成 選用大腸桿菌偏愛密碼子，優(yōu)化設計粉塵螨ENOA編碼基因序列，人工合成該基因，5’端含有BamH I酶切位點，3’端含有終止密碼和EcoR I酶切位點，合成基因克隆pUC57載體上測序確認，該實驗由南京金斯瑞公司完成。

1.2.3 pET-His-ENOA重組表達質粒的構建與原核表達 將pUC57-ENOA 雙酶切BamH I/EcoR I后電泳回收目的基因，克隆至原核表達載體pET-His，構建表達質粒pET-His-ENOA，經測序鑒定正確后轉化到大腸桿菌E.coliBL21(DE3)plysS感受態(tài)，挑選抗氨芐青霉素(Amp)陽性菌落，加入20 mL含100 μg/mL Amp的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min，過夜培養(yǎng)。次日轉種到1L滅菌的新鮮LB液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；待細菌生長處于對數(shù)生長期(A600nm=0.6左右)時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導表達。3 h后4 ℃離心收集菌體，進行SDS-PAGE電泳來檢測表達情況。

1.2.4 重組ENOA蛋白純化 以10 mL/g濕菌體的比例加入適量50 mmol/L Tris+150 mmol/L NaCl(pH8.0)蛋白抽提溶液，混勻并加入溶菌酶，冰浴攪拌溶解30 min；冰浴超聲波破碎細菌后4 ℃離心(10 000 r/min) 20 min，取上清液上樣到Ni2+-Chelating Sepharose層析柱進行蛋白純化，測定蛋白濃度和SDS-PAGE純度。

1.2.5 重組ENOA催化活性的測定 參照Pancholi報道的方法[11]測定粉塵螨ENOA的酶催化活性，ENOA可將2-磷酸甘油酸(2-phosphoglyceric acid，2-PGA)轉化成磷酸烯醇式丙酮酸phosphoenolpyruvic acid, PEP)，此過程可通過240 nm吸光度的變化進行檢測。配制酶活檢測緩沖液后，加入2 mmol/L的2-PGA，充分混勻；加入終濃度為20 μg/mL的高純度粉塵螨ENOA蛋白混勻，迅速檢測240 nm波長處的紫外吸收值，以10 s為間隔，連續(xù)測定3 min；以BSA作為陰性對照蛋白，繪制在240 nm時的吸光度吸光度變化曲線。

1.2.6 ENOA 3D結構模擬及RA相關表位肽的合成 以人ENOA 3D結構(PDB：2psnA)作為參考模板，運用在線軟件SWISS-MODEL對粉塵螨ENOA 3D結構進行同源建模，獲得其3D模擬結構。J. D. Goules等[12]研究發(fā)現(xiàn)瓜氨酸(Citrulline，Cit)化的ENOA可刺激類風濕性關節(jié)炎患者產生對自身ENOA特異結合的IgG抗體。結合粉塵螨ENOA 3D結構分析其N端B細胞表位，并合成瓜氨酸化的粉塵螨ENOA和人ENOA的RA相關表位肽，序列如下(Cit為瓜氨酸)：

表位肽位置氨基酸序列DustMite_ENOA(5-21aa)CKIYA(Cit)QIFDS(Cit)GNPTLEHuman_ENOA(5-21aa)CKIHA(Cit)EIFDS(Cit)GNPTVE

1.2.7 IgG-ELISA試驗及其統(tǒng)計分析 用碳酸鹽緩沖液(pH9.0)將粉塵螨ENOA和人ENOA表位肽稀釋至4 μg/mL，取96孔酶標板，每孔加入100 μL， 置于4℃包被過夜；用含5% BSA的PBS溶液37 ℃封閉2 h；按照1∶5的比例稀釋RA患者血清及陰性對照血清37 ℃孵育1 h； 1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的鼠抗人IgG 37 ℃孵育1 h；用TMB進行顯色，室溫避光靜置10 min后，加入2 mol/L硫酸溶液終止反應；在450 nm波長處測定吸光度。應用SPSS13.0軟件，對數(shù)據采用獨立樣本t檢驗，P<0.05即為差異具有統(tǒng)計學意義；采用Pearson方法對相關性進行分析。

2 結 果

2.1 粉塵螨ENOA cDNA克隆及其分析

2.1.1 粉塵螨ENOA的cDNA克隆和測序分析 以粉塵螨cDNA文庫為模板，根據ENOA的序列設計特異性PCR引物，進行PCR合成得到ENOA的cDNA(圖1)克隆后進行Sanger測序分析。結合粉塵螨基因組和轉錄組的數(shù)據分析[8],本研究克隆了ENOA cDNA全長序列，共1 302 bp，編碼 433個氨基酸，已登錄GenBank (Accession No.KJ421213.1)。

M：DNA分子量 DL2000；1：ENOA cDNA PCR產物

M: DL2000 DNA marker; Lane 1: Products of ENOA cDNA.

圖1 PCR擴增ENOA cDNA電泳圖譜

Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR product of ENOA cDNA

2.1.2 粉塵螨ENOA蛋白序列同源檢索 登錄GenBank數(shù)據庫，利用BLAST軟件在線進行蛋白質同源檢索，結果顯示本研究克隆的ENOA屬于類烯醇化酶超家族中的一員，氨基酸序列與人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)和果蠅(Drosophilamelanogaster)的ENOA同源性分別為72%、71%和65%(圖2)。

圖2 粉塵螨ENOA氨基酸序列與其它物種間的比對

2.2 粉塵螨ENOA基因的人工合成、表達及其蛋白純化

2.2.1 pET-ENOA重組表達質粒的構建與鑒定 依據粉塵螨ENOA蛋白的CDS編碼的氨基酸序列，采用E.coli偏愛密碼子人工合成粉塵螨ENOA基因，經DNA測序確正后申請GenBank，登錄號為No. KJ421214.1。該基因 5’端和3’端分別含BamHI和EcoRI位點。將ENOA目的基因克隆至表達載體pET-HisBamHI和EcoRI之間，雙酶切鑒定并經DNA序列確證(圖3)。

M：DNA標志物 DL2000；1:pET-His-ENOABamHI/EcoRI雙酶切產物

M: DL2000 DNA Marker; Lane 1: products of pET-His-ENOA double cut byBamHI/EcoRI.

圖3 pET-His-ENOA重組質粒BamHI/EcoRI雙酶切

Fig.3 Electrophoresis of products of pET-His-ENOA double cut byBamHI/EcoRI

2.2.2 原核系統(tǒng)表達ENOA重組蛋白 測序正確的pET-His-ENOA重組表達質粒，轉化至E.coliBL21(DE23)plysS，誘導重組蛋白的表達，分別處理誘導前后菌體進行SDS-PAGE凝膠電泳，目的條帶大小為47 kDa左右(如圖4)。重組蛋白溶液經Ni2+Sepharose FF柱層析純化，濃縮后上樣Superdex200層析純化， 經SDS-PAGE分析獲得純的重組ENOA蛋白,濃度為1.2 mg/mL(如圖4)。

2.3 重組ENOA酶活性測定 ENOA酶可轉化2-PGA為PEP；在240 nm波長下, PEP具有較高的吸光度, 而PGA的吸光度很低。2-PGA加入BSA后在240 nm時的吸光度無變化，BSA在此實驗中沒有表現(xiàn)出酶催化活性；而2-PGA加入重組ENOA蛋白后在240 nm時的吸光度不斷增加，并在一定時間后趨于穩(wěn)定，表現(xiàn)出酶催化活性(圖5)。

2.4 ENOA蛋白3D結構與RA相關表位分析

2.4.1 粉塵螨ENOA蛋白 3D結構模擬 利用SWISS-MODEL在線軟件，參考模板(template: 2psnA)對粉塵螨ENOA蛋白進行同源建模，模擬其3D分子結構(圖6)。預測粉塵螨ENOA蛋白結構模型中，α螺旋含量為45%，β折疊片為45%。

M：預染蛋白質分子量標志物；1：誘導前；2： IPTG誘導；3：重組蛋白經Ni Sepharose親和層析純化；4：重組蛋白經Superdex 200凝膠過濾層析純化M: Pre-stained Protein Ladder; Lane 1: Before introduction; Lane 2: After introduction by IPTG; Lane 3: rENOA protein purified by Ni2+chelating resin; Lane 4: rENOA protein purified by Superdex 200 gel filtration.

圖4 pET-His-ENOA重組質粒的誘導表達純化

Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant ENOA

圖5 重組ENOA酶催化活性測定

圖6 粉塵螨ENOA蛋白 3D結構模擬

2.4.2 人工合成與RA相關的表位肽 粉塵螨ENOA表位肽：CKIYA(Cit)QIFDS(Cit)GNPTLE，分子量為2113.44，HPLC分析合成肽純度>98%，其中N端Cys含有SH，便于偶聯(lián)到BSA上。人ENOA表位肽：CKIHA(Cit)EIFDS(Cit)GNPTVE，分子量2074.36，HPLC分析合成肽純度>98%，其中N端Cys含有SH，便于偶聯(lián)到BSA上。

2.4.3 IgG-ELISA測定表位肽與RA患者血清結合反應 取64份RA患者血清及26份健康對照血清作為檢測對象。實驗結果顯示，粉塵螨ENOA表位肽與RA患者血清IgG的結合率為17.2%(11/64)，與健康人血清無結合活性(cut off值為0.353)，見圖7(P<0.05)。人ENOA表位肽與RA患者血清IgG的結合活率為10.9% (7/64)，與1例健康人血清有結合活性(cut off值為0.3478)，見圖8(P<0.05)，結合率低于J. D. Goules等[17]的報道(37.59%)，可能與不同人群有關。粉塵螨ENOA表位肽與人ENOA表位肽兩者結合RA患者IgG抗體具有較高的相關性(R2=0.9522，P<0.05)，見圖9。

圖7 粉塵螨ENOA表位肽與RA患者及健康對照血清IgG結合反應

Fig.7 IgG binding reactivity by Der f α-enolase epitope peptide against IgG antibodies from RA serum and healthy controls respectively

圖8 人ENOA表位肽與RA患者及健康對照血清IgG結合反應

Fig.8 IgG binding reactivity by human α-enolase epitope peptide against IgG antibodies from RA serum and healthy controls respectively

圖9 粉塵螨ENOA表位肽和人ENOA表位肽與RA血清IgG結合反應的相關性比較

Fig.9 Correlation between IgG binding activity of Der f α-enolase and human α-enolase epitope peptides against IgG antibodies from RA patient’s serum

3 討 論

3.1 粉塵螨α-烯醇化酶的克隆表達及酶活性測序 本課題組基于高通量測序解析了粉塵螨基因組和轉錄組[8]；這有利于克隆粉塵螨未知基因開展新的研究。本研究克隆的粉塵螨ENOA cDNA序列1 302 bp，編碼433個氨基酸，其結構基因由5個外顯子和4個內含子組成；克隆測序結果與高通量測序后拼接的轉錄組序列一致。此外序列比對后發(fā)現(xiàn)，ENOA在不同物種之間的序列同源性較高，這說明ENOA基因在不同物種生物體內是高度保守的。本研究獲得了可溶性表達具有酶活性的重組粉塵螨ENOA，為進一步研究提供了生物原材料。

研究表明,真菌中 α-Enolase是一類高度保守的過敏原[13]；在部分霉類和乳膠過敏患者體內表現(xiàn)過敏原性；α-Enolase在鏈格孢霉(Alternariaalternata)和多主枝孢菌(Cladosporiumherbarum)過敏患者中具有較高的IgE結合活性[14]；天然乳膠中的主要過敏原Hev b 9就是α-Enolase，它與霉菌α-Enolase有交叉反應性[15]。研究報道鏈格孢霉(A.alternata)的α-Enolase——Alt a 5是該真菌的第二組主要過敏原，22%的鏈格孢霉過敏患者中均檢測到抗α-Enolase IgE活性[16]。在多主枝菌(C.herbarum)α-Enolase相關的研究中發(fā)現(xiàn)，同樣作為該真菌的第二主要過敏原的α-Enolase在22%的多主枝孢菌(C.herbarum)過敏患者中檢測到IgE陽性[17-18]。此外，在人念珠菌(Candidaalbicans)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、產朊假絲酵母(Candidautilis)的α-Enolase作為主要過敏原并具有交叉反應性[19]。粉塵螨是過敏性疾病最主要的過敏原來源之一，從這一物種中發(fā)現(xiàn)新的過敏原蛋白成分是研究過敏性疾病的基礎[20]。本研究最初設想克隆粉塵螨α-Enolase研究其致敏原性，但實驗結果顯示重組粉塵螨α-Enolase與過敏患者及健康對照者血清IgE均有相當一部分反應，兩組無顯著差異；粉塵螨α-Enolase是否是過敏原尚待進一步研究。

3.2 粉塵螨ENOA與人ENOA自身免疫交叉反應 人體內有多種蛋白與細菌、病原體等外來抗原具有一定的氨基酸序列同源性，這些外來抗原有可能與人體自身蛋白產生交叉免疫反應[1]。粉塵螨ENOA作為外來抗原，與人體自身ENOA抗原氨基酸序列同源性高達72%，可能形成為共同交叉抗原；由交叉抗原刺激人體產生的抗粉塵螨ENOA的抗體，可與有關人體組織中人ENOA發(fā)生交叉免疫反應，有可能進一步引起免疫損傷。

在本研究中，我們模擬粉塵螨ENOA蛋白的3D結構，分析其潛在的B表位區(qū)段，結合與人ENOA表位區(qū)段的分析，設計合成了粉塵螨ENOA與人ENOA的表位肽(5-21aa)，檢測ENOA表位肽是否結合RA患者血清IgG。本實驗發(fā)現(xiàn)粉塵螨ENOA表位肽與部分RA患者血清的IgG結合，與健康對照血清無結合活性；粉塵螨ENOA的表位肽和人ENOA表位肽結合RA患者血清IgG抗體水平具有較高的相關性(R2=0.9522)。這表明粉塵螨ENOA與人ENOA存在抗原交叉反應性。一直以來，塵螨是否與自身免疫性疾病相關缺少確切的實驗證據；本研究發(fā)現(xiàn)提供了直接線索。但粉塵螨與自身免疫性疾病的確切關系需要進一步深入研究。

[1]Pancholi V. Multifunctional alpha-enolase:its role in diseases[J]. Cell Mol Life Sci, 2001, 58: 902-920.

[2]Johnstone SA, Waisman DM, Rattner JB. Enolase is present at the centrosome of HeLa cells[J]. Exp Cell Res, 1992, 202(2): 458-463.

[3]Zhu LA, Fang NY. Alpha-enolase: old protein with new faces[J]. J Int Path Clin Med, 2007, 27(4): 347-350.

[4]Kinloch A, Tatzer V, Wait R, et al. Identification of citrullinated α-enolase as a candidate autoantigen in rheumatoid arthritis[J]. Arthritis Res Ther, 2005, 7(6): 1421-1429.

[5]Gitlits VM, Sentry JW, Matthew ML, et al. Autoantibodies to evolutionarily conserved epitopes of enolase in a patient with discoid lupus erythematosus[J]. Immunology, 1997, 92: 362-368.

[6]Valenta R, Niederberger V. Recombinant allergens for immunotherapy[J]. J Allergy Clin Immunol, 2007, 119(4): 826-830.

[7]Chapman MD, Smith AM, Vailes LD, et al. Recombinant allergens for immunotherapy[J]. Allergy Asthma Proc, 2002, 23(1): 5-8.

[8]Chan TF, Ji KM, Yim KY, et al. The draft genome, transcriptome and microbiome ofDermatophagoidesfarinaereveal a broad spectrum of dust mite allergens[J]. J Allergy Clin Immunol, 2014. (in press)

[9]Honda A, Ametani A, Matsumoto T, et al. Suppression of collagen-induced arthritis in DBA/1J mice by preimmunization with house dust mite extract[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2001, 65(5): 1063-1070.

[10]Bozek A, Kozlowska R, Jarzab J. The safety of specific immunotherapy for patients allergic to house-dust mites and pollen in relation to the development of neoplasia and autoimmune disease: a long-term, observational case-control study[J]. Int Arch Allergy Immunol, 2014, 163(4): 307-312.

[11]Pancholi V, Fischetti VA. α-Enolase, a novel strong plasmin(ogen) binding protein of the surface of pathogenic streptococci[J]. J Biol Chem, 1998, 273: 14503-14515.

[12]Goules JD, Goules AV, Tzioufas AG. Fine specificity of anti-citrullinated peptide antibodies discloses a heterogeneous antibody population in rheumatoid arthritis[J]. British Soc Immunol Clin Exper Immunol, 2013, 174: 10-17.

[13]Breitenbach M, Simon B, Probst G, et al. Enolases are highly conversed fungal allergens[J]. Int Arch Allergy Immunol, 1997, 113: 114-117.

[14]Simon-Nobbe B, Probst G, Kajava AV, et al. IgE-binding epitopes of enolases, a class of highly conserved fungal allergens[J]. J Allergy Clin Immunol, 2000, 106: 887-895.

[15]Wagner S, Breiteneder H, Simon-Nobbe B, et al. Hev b 9, an enolase and a new cross-reactive allergen from hevea latex and molds. Purification, characterization, cloning and expression[J]. Eur J Biochem, 2000, 267(24): 7006-7014.

[16]Achatz G, Oberkofler H, Lechenauer E, et al. Molecular characterization ofAlternariaalternataandCladosporiumherbarumallergens[J]. Adv Exp Med Biol, 1996, 409: 157-161.

[17]Ito K, Ishiguro A, Kanbe T, et al. Detection of IgE antibody againstCandidaalbicansenolase and its cross-reactivity toSaccharomycescerevisiaeenolase[J]. Clin Exp Allergy, 1995, 25: 522-528.

[18]Baldo BA, Baker RS. Inhalant allergies to fungi: reactions to bakers’ yeast (Saccharomycescerevisiae) and identification of bakers’ yeast enolase as an important allergen[J]. Int Arch Allergy Appl Immunol, 1988, 86: 201-208.

[19]Barki M, Koltin Y, Van Wetfiter M, et al. ACandidaalbicanssurface antigen mediating adhesion and autoaggregation inSaccharomycescerevisiae[J]. Infect Immun, 1994, 62(10): 4107-4111.

[20]Pawankar R, Canonica GW, Holgate ST, et al. World allergy organization (WAO) white book on allergy: Update 2013[M]. Geneva: WAO, 2013.

Cloning and expression of alpha-enolase gene fromDermatophagoidesfarinaeand identification of its N-terminal B-cell epitope

LUO Wen-li1,QIU Cong-ling1,YU Wei-jia1,LIU Zhi-gang1,2,JI Kun-mei1,2,CAI Ze-lang1,2

(1.InstituteofAllergyandImmunology,SchoolofMedicine,ShenzhenUniversity,Shenzhen518060,China;2.ShenzhenKeyLaboratoryofAllergyandImmunology,Shenzhen518060,China)

We aimed to clone and express cDNA of alpha-enolase from the dust miteDermatophagoidesfarina(Der f), and study the relationship between its N-terminal B-cell epitope and autoimmune disease. The cDNA of α-enolase was amplified from Der f cDNA library and sub-cloned into a pET-His vector to express inE.coliBL21(DE3)plysS. Recombinant α-enolase was purified and its enzyme activity was determined. The 3D structure was constructed by Swiss-Model. The N-terminal epitope peptide was synthesized and subjected to IgG-ELISA with the patients’ serum of rheumatoid arthritis vs healthy controls. Results showed that the gene encoding α-enolase was cloned from Der f (GenBank accession No. KJ421213.1). The pET-ENOA expression vector was constructed. High pure recombinant α-enolase was obtained with enzyme activity. ELISA demonstrated IgG binding to the citrullinated peptide from 11 of 64 rheumatoid arthritis (RA) patients’ serum samples, but was not bound by IgG antibodies from 26 healthy controls (P<0.05). The present study cloned and expressed α-enolase cDNA from the dust mite. The findings have revealed the dust mite α-enolase might be associated with human rheumatoid arthritis.

Dermatophagoidesfarina; alpha-enolase; rheumatoid arthritis；epitope

國家自然科學基金(No.31328014，No.31400786)、廣東省自然科學基金(No.2014A030313563)、深圳市科技計劃(No. JCYJ20120613113021045， JCYJ20130326112225593)

蔡澤浪, Email:szuczlang@163.com

1.深圳大學醫(yī)學院過敏反應與免疫學研究所，深圳 518060； 2.深圳市過敏反應與免疫學重點實驗室，深圳 518060

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.07.012

R384.4；R593.22

A

1002-2694(2015)07-0649-06

2014-11-26；

2015-06-03